響應(yīng)面法優(yōu)化蘆柑皮中檸檬苦素類化合物的提取工藝

湯海霞，董雅嫻，賁永光

(廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

蘆柑又名真柑、乳柑、柑果，是柑橘中最常見(jiàn)的品種之一，在我國(guó)南方廣泛種植，其味道芳香甘美，風(fēng)味獨(dú)特，具有生津止渴、和胃利尿等功效，在國(guó)內(nèi)外農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中占有非常重要的地位[1]。隨著蘆柑產(chǎn)量的逐年增加，蘆柑果皮的綜合利用就越發(fā)顯得重要。但是，國(guó)內(nèi)大部分蘆柑皮渣未得到充分利用，傳統(tǒng)做法是加工成動(dòng)物飼料、肥料或廢棄物處理，經(jīng)濟(jì)效益低，且易污染環(huán)境[2-4]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于資源節(jié)約和環(huán)境保護(hù)的重視，使得皮渣的綜合利用日益被關(guān)注。

蘆柑果皮中含有香精油、果膠、桔皮色素、柑橘纖維、黃酮類化合物和類檸檬苦素等功能性成分，這些成分在食品、醫(yī)藥等方面具有廣泛的用途。檸檬苦素類化合物也是蘆柑果皮中一種主要生理活性成分，是一類高度氧化的含呋喃環(huán)三萜類化合物，具有諸多生物學(xué)功能，如抗氧化性、抑菌性和抗腫瘤性等[5-7]。檸檬苦素類化合物在加工處理過(guò)程中容易發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，甚至?xí)蛊涫セ钚?。因此，在提取、分離、純化檸檬苦素類化合物的過(guò)程中必須嚴(yán)格控制溫度、pH值等因素[8]。

目前，檸檬苦素類化合物的主要提取方法有有機(jī)溶劑法、系統(tǒng)溶劑提取法、超聲波提取法、超臨界萃取法等[9-11]。相比傳統(tǒng)的提取方法，超聲提取具有提取時(shí)間短、節(jié)約溶劑、提取率高、應(yīng)用廣泛等優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)[12]。本文旨在探討超聲輔助提取蘆柑皮中檸檬苦素類化合物的工藝，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，以期為柑橘果皮的綜合利用提供理論依據(jù)與工藝參考。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

DFY-600搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器)；KQ-400DB型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司)；752N紫外/可見(jiàn)分光光度儀(上海儀電分析儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 原料與試劑

蘆柑(產(chǎn)地：福建漳州)，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院滕希峰講師鑒定為蕓香科柑橘屬(Citrus reticulata Blanco)蘆柑品種；檸檬苦素對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；石油醚、無(wú)水乙醇(分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；對(duì)二甲氨基苯甲醛、三氯化鐵、二氯甲烷(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；H2SO4(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品前處理

取蘆柑手工去皮，將果皮用自來(lái)水清洗干凈后，再用去離子水沖洗干凈，置于烘箱內(nèi)(40～50 ℃，48 h)烘至水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%左右，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)40目篩。稱量過(guò)篩后的蘆柑皮粉末的重量，放入錐形瓶中并加入石油醚(1 g蘆柑皮粉末加入100 mL石油醚)，密封，放置恒溫箱中，37 ℃浸泡脫脂10 h，抽濾除去石油醚后，放置烘箱中60 ℃干燥，干燥后放于密封袋中，備用。

2.2 檸檬苦素類化合物的測(cè)定方法

2.2.1 顯色劑的配置 顯色劑A液：將125 mg對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于100 mL的H2SO4和乙醇混合液中(H2SO465 mL，無(wú)水乙醇35 mL)，放冷備用。顯色劑B液：稱取FeCl39.0 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL；使用時(shí)，現(xiàn)配現(xiàn)用，將B溶液0.5 mL加入到A溶液，搖勻即可[1]。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取檸檬苦素對(duì)照品15.0 mg，溶于無(wú)水乙醇中后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，定容，得300 μg/mL的對(duì)照品溶液，待用。取1 mL，加入無(wú)水乙醇2 mL，再加5 mL顯色液，搖勻，靜置30 min后進(jìn)行光譜掃描，于500 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。

精密移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL對(duì)照品溶液于7個(gè)試管中，并以無(wú)水乙醇稀釋至3 mL，再分別加入5 mL顯色液，以檸檬苦素空白液為參比，顯色30 min后在500 nm處測(cè)定其吸光度。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.002 5x+0.002 5，R=0.999 1。

2.2.3 樣品的處理與測(cè)定 精密稱取1.5 g脫脂且干燥的蘆柑果皮粉于試管中，按一定料液比，加入一定濃度的提取溶劑，在一定超聲功率下超聲一定時(shí)間后，抽濾得到提取液，提取液經(jīng)減壓濃縮，濃縮液溶于二氯甲烷并過(guò)濾，濾液經(jīng)減壓濃縮后用無(wú)水乙醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，定容。精密吸取溶液3 mL，加入5 mL顯色劑，搖勻，靜置顯色30 min后于500 nm處測(cè)定吸光度。按下列公式計(jì)算檸檬苦素類化合物的提取率(Y)：

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的檸檬苦素類化合物質(zhì)量濃度，μg/mL；D為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；W為原料質(zhì)量，g。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 提取時(shí)間的選擇 精密稱取1.5 g脫脂且干燥的蘆柑果皮粉5份于試管中，固定液料比為15∶1(mL∶g)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲功率為400 W，考察超聲時(shí)間分別為12、14、16、18、20 min對(duì)檸檬苦素類化合物提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1(A)?？梢?jiàn),提取時(shí)間為14 min時(shí)，檸檬苦素類化合物的提取率最佳。

2.3.2 液料比的選擇 精密稱取1.5 g脫脂且干燥的蘆柑果皮粉5份于試管中，固定提取時(shí)間為14 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，超聲功率為400 W，考察液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1和25∶1(mL∶g)對(duì)檸檬苦素類化合物提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1(B)。可見(jiàn)，當(dāng)物料比為15∶1 mL/g時(shí)，檸檬苦素類化合物的提取率最佳。

2.3.3 超聲功率的選擇 精密稱取1.5 g脫脂且干燥的蘆柑果皮粉5份于試管中，固定提取時(shí)間為14 min，液料比為15∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，考察超聲功率為240、280、320、360、400 W對(duì)檸檬苦素類化合物提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1(C)?？梢?jiàn)，當(dāng)超聲功率為360 W時(shí)，檸檬苦素類化合物的提取率最佳。

2.3.4 提取溶劑體積分?jǐn)?shù)的選擇 精密稱取1.5 g脫脂且干燥的蘆柑果皮粉5份于試管中，固定提取時(shí)間為14 min，液料比為15∶1，超聲功率為360 W，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)對(duì)檸檬苦素類化合物提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1(D)?？梢?jiàn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%左右時(shí)，檸檬苦素類化合物的提取率最佳。

提取率//(mg?g-1)765432107654321076543210876543210101214161820222002402803203604004401015202530055060708090提取時(shí)間/min液料比/(mL∶g-1)超聲功率/W乙醇體積分?jǐn)?shù)/%ABCD

圖1提取時(shí)間(A)、料液比(B)、超聲功率(C)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)對(duì)檸檬苦素類化合物提取率的影響

Figure1Effect of time (A),solid-to-solvent ratio (B),ultrasonic power (C),ethanol concentration (D) on the extraction yield of limonoids

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬苦素類化合物的提取工藝

2.4.1 因素與水平的選取 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用4因素3水平響應(yīng)面分析方法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以1、0、-1分別代表自變量的高中低水平，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 因素與水平設(shè)計(jì)表Table 1 The factors and levels for RSA

注：X1=(X1-80)/10；X2=(X2-360)/40；X3=(X3-15)/5；X4=(X4-14)/2。

2.4.2 回歸方程的建立 在4因子Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)中試驗(yàn)號(hào)1-24是析因試驗(yàn)點(diǎn)，試驗(yàn)號(hào)25-29是零點(diǎn)試驗(yàn)，其中析因點(diǎn)為自變量X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)區(qū)域?yàn)橹行狞c(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。以X1、X2、X3、X4為自變量，以原料中檸檬苦素類化合物提取率為響應(yīng)值(Y)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。將結(jié)果利用軟件DesignExpert8.0分析處理，得到以檸檬苦素提取率(Y)為響應(yīng)值的二次回歸方程：

Y=8.11-0.042X1+0.064X2-0.017X3+0.032X4-0.024X1X2-6.711-3X1X3-0.023X1X4-0.097X2X3-0.056X2X4+0.11X3X4-1.03X12-0.22X22-0.36X32-0.20X42。

2.4.3 回歸模型分析 用軟件DesignExpert8.0對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，以檸檬苦素類化合物提取率為響應(yīng)值的回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

由表3可知，失擬項(xiàng)F值=3.05，檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明失擬平方和較小，基本是由試驗(yàn)誤差等偶然因素引起的，擬合良好?；貧w項(xiàng)F值=16.24，檢驗(yàn)極顯著(P<0.01)，且回歸方程決定系數(shù)R2為0.942 0，修正決定系數(shù)AdjR2為0.884 0，說(shuō)明該模型與實(shí)際擬合良好，可用于蘆柑果皮中提取檸檬苦素類化合物的分析和預(yù)測(cè)。

2.4.4 各因素交互作用分析 為進(jìn)一步直觀說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)(X4)、提取時(shí)間(X1)、超聲功率(X3)和液料比(X2)之間的相互作用對(duì)檸檬苦素類化合物提取率的影響，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果做出相應(yīng)的響應(yīng)面3D圖和等高圖，見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，各因素之間兩兩交互作用對(duì)檸檬苦素類化合物提取率的影響均均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.5 最佳工藝與驗(yàn)證試驗(yàn) 由軟件DesignExpert8.0預(yù)測(cè)出檸檬苦素類化合物提取條件優(yōu)化結(jié)果為：提取時(shí)間14.29min，液料比15.25∶1 (mL∶g)，超聲功率358.61W，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，檸檬苦素類化合物提取率預(yù)測(cè)可達(dá)8.12mg/g。為實(shí)際操作方便，將上述最優(yōu)提取條件簡(jiǎn)化為：提取時(shí)間14min，液料比15∶1 (mL/g)，超聲功率360W，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果測(cè)得提取率分別為8.07、8.10、8.03mg/g，平均提取率為8.07mg/g，RSD=0.01%，與理論預(yù)測(cè)值相差很小，且RSD值較小，精密度較好，說(shuō)明采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取條件可靠。

表2 Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Design and experimental results of Box-Benhnken response surface method

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The analysis of variance

注：*P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；R2=0.942 0，AdjR2=0.884 0。

X2:液料比/(mL∶g)X4:乙醇體積分?jǐn)?shù)/%X1:提取時(shí)間/minX3:超聲功率/WX4:乙醇體積分?jǐn)?shù)/%X4:乙醇體積分?jǐn)?shù)/%X3:超聲功率/WX1:提取時(shí)間/minX1:提取時(shí)間/minX3:超聲功率/WX2:液料比/(mL∶g)X2:液料比/(mL∶g)BACDEF

圖2各因素交互作用的響應(yīng)面圖

Figure2ResponsiveSurfaceandcontoursoftheinteractionofeachfactors

3 討論

本文對(duì)蘆柑皮中檸檬苦素類化合物的超聲提取工藝進(jìn)行了研究，考察了超聲功率、提取時(shí)間、液料比、提取溶劑濃度等因素對(duì)檸檬苦素類化合物提取率的影響，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)選最佳提取工藝條件，在此最優(yōu)工藝條件下，蘆柑皮中檸檬苦素類化合物的提取率為8.07 mg/g，與文獻(xiàn)報(bào)道的用酸堿水提取蘆柑皮中檸檬苦素的結(jié)果(0.133 mg/g和0.117 mg/g)[14-15]比較，本文的提取率明顯提高，且減少了酸堿和有機(jī)溶劑等的使用，污染環(huán)境可能性小，體現(xiàn)了超聲技術(shù)操作簡(jiǎn)單、高效和節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。