晚期卵巢癌患者卵巢癌組織中免疫細(xì)胞表達水平與新輔助化療敏感性的關(guān)系

李賀群，徐暉，嚴(yán)波，侯瑩，黃大福，張雷

南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，南京 2112000

卵巢癌是臨床發(fā)病率較高的婦科惡性腫瘤之一。21世紀(jì)以來，女性承擔(dān)的社會責(zé)任越來越重，工作和生活節(jié)奏日益緊張，卵巢癌的發(fā)病率逐年上升[1]。由于卵巢解剖位置隱匿，早期臨床癥狀不典型，多數(shù)患者確診時已至中晚期，甚至已發(fā)生盆腔和腹腔轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，5年生存率僅為30%[2]。目前，國際上普遍認(rèn)可的晚期卵巢癌標(biāo)準(zhǔn)的治療方案為腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合術(shù)后化療[3]。但由于部分患者確診時已發(fā)生盆腔和腹腔廣泛的種植轉(zhuǎn)移，難以實現(xiàn)滿意減瘤，因此，越來越多的學(xué)者建議，卵巢癌可先進行新輔助化療[4]，降低腫瘤負(fù)荷從而為患者創(chuàng)造能夠達到滿意減瘤的手術(shù)條件。近年來，隨著新輔助化療方法的不斷進展，越來越多的晚期卵巢癌患者可實現(xiàn)滿意減瘤，但仍有部分患者對新輔助化療的敏感性不高，因此，如何預(yù)測這類患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險，成為新輔助化療亟待解決的難題。免疫微環(huán)境一直是腫瘤領(lǐng)域研究的熱點，與多種惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。研究顯示，卵巢癌組織和癌旁組織中均浸潤著大量的免疫細(xì)胞，包括CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytoxic T lymphocyte，CTL）和叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（forkhead/wingedhelix transcription factor，F(xiàn)OXP3）調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）[5]，但目前關(guān)于腫瘤局部免疫與新輔助化療預(yù)后的相關(guān)性研究仍較少。本研究分析晚期卵巢癌患者腫瘤浸潤免疫細(xì)胞對新輔助化療敏感性的預(yù)測價值，為后續(xù)個體化治療提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2013年7月至2017年6月在南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院接受新輔助化療的晚期卵巢癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)活檢和細(xì)胞學(xué)檢查確診為晚期卵巢癌；②術(shù)前接受1～2個療程的以鉑類藥物為基礎(chǔ)的新輔助化療方案治療；③臨床資料完整；④復(fù)發(fā)后隨訪時間≥6個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①新輔助化療前接受放療或化療的患者；②新輔助化療前接受激素替代治療或免疫治療的患者；③依從性差的患者。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入82例晚期卵巢癌患者，年齡26～71歲，平均年齡為（51.05±7.17）歲；依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均為Ⅲ～Ⅳ期。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 所有患者均接受紫杉醇/多西他賽+卡鉑/順鉑化療方案：第1天，紫杉醇135～175 mg/m2或多西他賽75～100 mg/m2，靜脈滴注；第2 天，卡鉑 300～400 mg/m2或順鉑75～100 mg/m2，靜脈滴注。同時給予對癥處理，每3周為1個療程，共治療1～2個療程，療程結(jié)束停藥2周，所有患者接受婦科檢查和影像學(xué)檢查，無手術(shù)禁忌證的患者可接受腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)。

1.2.2 染色方法 按照病例編號調(diào)取在本院病理科存檔的石蠟包埋的病理組織，脫蠟水化后切片，置于載玻片上，烘干48 h后備用。將組織切片逐步進行二甲苯脫蠟（二甲苯I和二甲苯Ⅱ各5 min）和乙醇梯度水化（100%乙醇和95%乙醇各5 min），加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗5 min，重復(fù)3次；然后加入檸檬酸緩沖液進行組織抗原修復(fù)，室溫下冷卻30～60 min，PBS沖洗3次。滴加H2O2，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次；滴加一抗（1∶200稀釋），4℃孵育過夜，PBS沖洗3次；滴加二抗，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3次；加入二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑顯色；蘇木精復(fù)染；脫水后，采用中性樹膠封片。室溫下干燥48 h后，由2名以上經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師讀片并分析免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，不一致時由第3名醫(yī)師按照評分標(biāo)準(zhǔn)進行評定。

1.3 觀察指標(biāo)和評價標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 臨床療效 依據(jù)實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（RECIST 1.1）[6]評估臨床療效：完全緩解（complete response，CR），腫瘤病灶完全消失；部分緩解（partial response，PR），靶病灶最大徑之和縮小≥30%；疾病進展（progressive disease，PD），靶病灶最大徑之和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶；疾病穩(wěn)定（stable disease，SD），介于PR和PD之間?？陀^緩解率（objective response rate，ORR）=（CR+PR）例 數(shù)/總 例 數(shù) ×100%。病理學(xué)完全緩解（pathologic complete response，pCR）：卵巢癌組織和淋巴結(jié)內(nèi)未見浸潤性腫瘤細(xì)胞殘留[7]。

1.3.2 染色結(jié)果判定 CD8+CTL和FOXP3+Treg均定位于細(xì)胞核，免疫組織化學(xué)染色均呈棕黃色，選擇細(xì)胞浸潤的中位數(shù)作為判定截點，高于中位數(shù)即為高表達，低于中位數(shù)即為低表達。由2名經(jīng)驗豐富的病理科專業(yè)醫(yī)師單獨讀片，若判定結(jié)果不一致，協(xié)商后確定最終結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對-數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較用χ2檢驗；晚期卵巢癌患者ORR的影響因素采用Logistic回歸分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD8+CTL和FOXP3+Treg在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達

CD8表達于細(xì)胞膜，散在分布于卵巢癌組織內(nèi)，聚集分布于癌旁組織；FOXP3表達于細(xì)胞核，在卵巢癌組織和癌旁組織多呈散在分布，少部分呈聚集分布（圖1）。新輔助化療前，癌旁組織中CD8+CTL和FOXP3+Treg表達水平均明顯高于卵巢癌組織（t=12.598，P＜0.01；t=17.537，P＜0.01）。新輔助化療后，癌旁組織中CD8+CTL和FOXP3+Treg的表達水平均明顯高于卵巢癌組織（t=12.172，P＜0.01；t=9.467，P＜0.01）；且FOXP3+Treg在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達水平均明顯低于新輔助化療前（t=13.555，P＜0.01；t=18.034，P＜0.01）；但CD8+CTL在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達水平與新輔助化療前比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

圖1 CD8+CTL和FOXP3+Treg在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達情況（×100）

表1 CD8+CTL和FOXP3-+Treg在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達水平（%，x±s）

2.2 CD8+CTL和FOXP3+Treg的陽性表達率與晚期卵巢癌患者臨床特征的關(guān)系

不同分化程度和FIGO分期的晚期卵巢癌患者的卵巢癌組織和癌旁組織CD8+CTL和FOXP3+Treg陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表 2）

表2 不同臨床特征晚期卵巢癌患者CD8+CTL和FOXP3+Treg的陽性表達情況

2.3 晚期卵巢癌患者ORR影響因素的單因素分析

新輔助化療后，61例患者達到客觀緩解，ORR為74.39%。單因素分析結(jié)果顯示，不同F(xiàn)IGO分期、卵巢癌組織FOXP3+Treg表達水平、癌旁組織CD8+CTL表達水平的晚期卵巢癌患者的ORR比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表3）

表3 82例晚期卵巢癌患者ORR影響因素的單因素分析

2.4 新輔助化療后晚期卵巢癌患者ORR影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的FIGO分期、卵巢癌組織FOXP3+Treg表達水平、癌旁組織CD8+CTL表達水平納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，癌旁組織CD8+CTL高表達、卵巢癌組織FOXP3+Treg低表達、FIGO分期為Ⅳ期是ORR的影響因素。（表 4）

表4 新輔助化療后82例晚期卵巢癌患者ORR影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.5 緩解組和未緩解組CD8+CTL和FOXP3+Treg的表達情況

新輔助化療后，15例患者達到pCR，pCR率為18.29%，并依據(jù)是否達到pCR分為緩解組（n=15）和未緩解組（n=67）。未緩解組患者卵巢癌組織和癌旁組織中FOXP3+Treg表達水平均高于緩解組患者（t=2.144，P=0.035；t=8.765，P＜0.01）；但兩組患者CD8+CTL表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表5）

3 討論

腫瘤免疫微環(huán)境一直都是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點和難點。腫瘤細(xì)胞本身具有免疫原性，可被正常的免疫系統(tǒng)識別并殺滅；但腫瘤細(xì)胞又可以分泌炎性因子，降低自身免疫原性，從而逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊，這就是所謂的“免疫逃逸”。研究顯示，化療、放療等抗腫瘤治療的敏感性均與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)[8]。

表5 緩解組和未緩解組晚期卵巢癌-患者CD8+CTL和FOXP3+Treg的表達情況（%，x±s）

卵巢癌是病死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一[9]，因卵巢的解剖位置特殊且缺乏典型的早期臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者確診時已至中晚期。目前，臨床一般采用減瘤術(shù)聯(lián)合術(shù)后輔助放化療治療晚期卵巢癌，但多數(shù)患者很難達到滿意減瘤。為提高滿意減瘤率，20世紀(jì)70年代，Griffiths提出將新輔助化療作為晚期卵巢癌患者可供選擇的治療方案，即在減瘤術(shù)前先進行數(shù)個療程的化療，使病灶松動壞死、腹腔積液量減少后再實施減瘤術(shù)。Denkert等[10]學(xué)者認(rèn)為，新輔助化療前腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）數(shù) 與pCR密切相關(guān)，TIL數(shù)越多，患者接受新輔助化療后pCR率越高。表明腫瘤局部免疫反應(yīng)可提高化療的敏感性。CD8+CTL和FOXP3+Treg是兩類最重要的免疫功能相反的淋巴細(xì)胞，前者具有細(xì)胞毒性可使腫瘤細(xì)胞凋亡，而后者可抑制或分泌抑制性細(xì)胞因子誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受，從而導(dǎo)致免疫抑制[11-12]。本研究旨在探討新輔助化療對晚期卵巢癌患者局部免疫微環(huán)境的影響，以及CD8+CTL和FOXP3+Treg對新輔助化療敏感性的影響。

本研究首先探討新輔助化療前后腫瘤局部免疫細(xì)胞浸潤的變化情況，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP3+Treg在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達水平均明顯低于新輔助化療前（P＜0.05）；但CD8+CTL在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達水平與新輔助化療前比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表明卵巢癌組織局部免疫能力增強，且FOXP3+Treg對化療的敏感性更強。但有研究顯示，化療后CD8+和FOXP3+細(xì)胞數(shù)均有所降低，且CD8+/FOXP3+比值與化療前相比有所增加[13]。這可能是因為腫瘤免疫微環(huán)境本身極為復(fù)雜，不同的化療方案、化療時間和腫瘤類型會導(dǎo)致腫瘤的免疫狀態(tài)不甚相同。此外，Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中FOXP3+低表達水平的卵巢癌患者的pCR率更高，與本研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果顯示，未緩解組患者卵巢癌組織和癌旁組織FOXP3+Treg表達水平均高于緩解組患者，表明癌旁組織FOXP3+Treg表達水平可能與化療達到pCR密切相關(guān)。

對新輔助化療敏感性較高的腫瘤患者更容易實現(xiàn)滿意減瘤，因此，評估新輔助化療的治療效果，對實施后續(xù)個體化治療至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，新輔助化療前，癌旁組織CD8+CTL高表達、卵巢癌組織FOXP3+Treg低表達是ORR的影響因素。表明新輔助化療前，患者腫瘤局部免疫反應(yīng)越高，對新輔助化療敏感性越高。

綜上所述，晚期卵巢癌患者腫瘤局部組織FOXP3+細(xì)胞浸潤狀態(tài)可作為新輔助化療敏感性的有效預(yù)測指標(biāo)，且新輔助化療后患者腫瘤局部組織FOXP3+低表達可能與實現(xiàn)pCR密切相關(guān)。目前，臨床采用單抗抑制T細(xì)胞免疫抑制及腫瘤局部的免疫抑制狀態(tài)，以期提高機體的免疫反應(yīng)，治療效果較理想。但仍需進一步探討腫瘤患者在接受新輔助化療前，是否可先給予某種單抗以提高其對化療的敏感性。