宮頸病變組織中CDC7和PHH3蛋白的表達(dá)及臨床意義△

王海燕，丁燕青海大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，青海 西寧 810001

2甘肅省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，甘肅 蘭州 7300300

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病的年輕化趨勢越來越明顯，嚴(yán)重危害女性的身體健康和生活質(zhì)量。宮頸癌主要與高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染有關(guān)，HPV感染可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失常并發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移[1]。目前，規(guī)范化的宮頸癌篩查可顯著降低其發(fā)病率，但仍會出現(xiàn)細(xì)胞學(xué)和HPV檢查假陰性的問題，因此，對宮頸癌進(jìn)行早期診斷及預(yù)后評估仍是一個亟待解決的問題。磷酸化組蛋白H3（phospho histone H3，PHH3）是一種抗磷酸化的組蛋白H3的抗體[2]，組蛋白H3的磷酸化與有絲分裂染色體的濃縮相關(guān)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，是一個具有潛在價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物，與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。細(xì)胞周期的失調(diào)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長，且對腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后有重要意義[3]。研究顯示，細(xì)胞分裂周期蛋白7（cell division cycle protein 7，CDC7）在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，在所有轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞中也均顯示高表達(dá)，使其成為目前腫瘤研究的重要標(biāo)記和靶點(diǎn)[4]。表明CDC7蛋白是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。目前，國內(nèi)關(guān)于宮頸癌PHH3與CDC7的表達(dá)水平及其相關(guān)性的研究較少。本研究探討不同宮頸病變組織中CDC7及PHH3的表達(dá)水平，分析其與宮頸癌臨床特征的關(guān)系，為宮頸癌的早期診斷提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年8月至2017年5月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院接受病理組織學(xué)檢測的宮頸疾病患者的組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)病理活檢證實(shí)為宮頸鱗癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）或?qū)m頸炎。排除標(biāo)準(zhǔn)：①宮頸鱗癌患者術(shù)前接受放化療及免疫治療；②合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤的患者。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入144例宮頸疾病患者，年齡21～78歲，平均年齡（48.2±5.6）歲。宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查：陰性28例，無明確意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）16例，低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）32例，不除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變的不典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypical squamous cells-cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion，ASC-H）40例，高度鱗狀上皮內(nèi)病變（highgrade squamous intraepithelial lesion，HSIL）28 例 。病理學(xué)檢測結(jié)果：正常宮頸組織28例，CINI級30例，CINⅡ～Ⅲ級32例，宮頸鱗癌44例，宮頸腺癌10例。根據(jù)病理學(xué)檢測結(jié)果，本研究共納入54例宮頸癌患者，年齡：＜55歲24例，≥55歲30例；病理分級：高34例，低中20例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無18例，有36例；臨床分期：I～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期31例。

1.2 主要試劑

兔抗人CDC7單克隆抗體[稀釋濃度為（1∶50）～（1∶500）]購自美國Santa Cruz公司，兔抗人PHH3單克隆抗體（稀釋濃度為1∶200）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測CDC7和PHH3蛋白表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)染色法檢測144例宮頸病變患者宮頸組織中CDC7和PHH3蛋白的表達(dá)情況。取組織標(biāo)本常規(guī)脫水包埋，5 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟5 min，重復(fù)3次。乙醇梯度水化，3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗 5 min，重復(fù) 3次。滴加5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液，37℃孵育30 min。滴加一抗（稀釋濃度為1∶100），4 ℃孵育過夜，PBS沖洗5 min，重復(fù)3次，滴加二抗室溫孵育30 min，DAB溶液顯色，鏡下觀察顯色反應(yīng)，顯色結(jié)束后置于流動水沖洗，蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知CDC7和PHH3陽性表達(dá)的宮頸病變組織作為陽性對照。采用累積光密度（integrated optical density，IOD）值表示 CDC7和 PHH3蛋白的表達(dá)水平。

1.4 結(jié)果判定

宮頸組織CDC7和PHH3蛋白均主要定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核棕黃色染色為CDC7和PHH3表達(dá)陽性，其表達(dá)水平以陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)算，即200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)10個視野中陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，＜10%判定為陰性，≥10%判定為陽性。所有組織標(biāo)本均由2名病理醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行評定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDC7和PHH3蛋白的陽性表達(dá)情況

正常宮頸組織中未見CDC7和PHH3蛋白陽性表達(dá)；CINI～Ⅲ組織中，CDC7和PHH3蛋白陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多；宮頸腺癌和宮頸鱗癌組織中，CDC7和PHH3蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯增多且染色逐漸加深。（圖1、圖2）

2.2 CDC7和PHH3蛋白陽性表達(dá)率的比較

病理學(xué)檢測結(jié)果中，CDC7和PHH3蛋白在正常宮頸組織、CINI級、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸腺癌和宮頸鱗癌中的陽性表達(dá)率明顯升高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=61.509，P＜0.01；χ2=54.966，P＜0.01）。在宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果中，CDC7和PHH3蛋白在正常宮頸組織、ASCUS、LSIL、ASC-H和HSIL中的陽性表達(dá)率明顯升高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=50.406，P＜0.01；χ2=54.761，P＜0.01）。（表1）

2.3 不同臨床特征宮頸癌組織中CDC7和PHH3蛋白的陽性表達(dá)情況

不同臨床分期的宮頸癌患者的CDC7蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理分型和病理分級的宮頸癌患者CDC7蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和臨床分期的宮頸癌患者PHH3蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、病理分型及病理分級的宮頸癌患者的PHH3蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表 2）

2.4 不同程度宮頸病變組織中CDC7和PHH3蛋白陽性表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，CDC7陽性表達(dá)與PHH3陽性表達(dá)呈明顯正相關(guān)（r=0.390，P＜0.01）。

圖1 正常宮頸組織及不同程度宮頸病變組織中CDC7蛋白的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×200）

圖2 正常宮頸組織及不同程度宮頸病變組織中PHH3蛋白的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×200）

表1 144例宮頸疾病患者的宮頸組織中CDC7和PHH3蛋白陽性表達(dá)情況

表2 不同臨床特征宮頸癌組織中CDC7和PHH3蛋白的表達(dá)情況（n=54）

3 討論

細(xì)胞分子生物學(xué)研究認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生本質(zhì)上是由于細(xì)胞周期的調(diào)控紊亂導(dǎo)致，與參與DNA復(fù)制的相關(guān)蛋白密切相關(guān)[3]。檢測影響細(xì)胞周期調(diào)控的生物標(biāo)志物，可以預(yù)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

CDC7蛋白是參與DNA復(fù)制的重要蛋白之一。CDC7蛋白在細(xì)胞有絲分裂進(jìn)入S期時(shí)發(fā)揮重要作用，且該蛋白的表達(dá)在整個細(xì)胞周期中相對恒定，但其活性會隨細(xì)胞周期的變化而改變。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）沉默CDC7的表達(dá)，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Rodriguez-Acebes等[5]對乳腺癌進(jìn)行了重點(diǎn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDC7蛋白高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)展加速、腫瘤細(xì)胞分化阻滯、基因組不穩(wěn)定等，表明CDC7蛋白的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。因此，可采用CDC7蛋白作為生物學(xué)標(biāo)志物，評估腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)，CDC7蛋白可能具有作為一類新的抗腫瘤藥物模型的潛能。

研究顯示，CDC7和PHH3蛋白在部分腫瘤中的表達(dá)具有相關(guān)性[6]。PHH3蛋白可協(xié)助評估子宮內(nèi)膜癌的病理分級，并可作為核分裂的標(biāo)志物，定量分析細(xì)胞的增殖情況[7]。PHH3蛋白定位于細(xì)胞有絲分裂早期的細(xì)胞核，能明確反映正常、凋亡和退變的細(xì)胞核，提高辨認(rèn)細(xì)胞核分裂的靈敏度及特異度。PHH3蛋白高表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長，因此，檢測PHH3蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，可降低細(xì)胞學(xué)檢測中的假陰性率，并可鑒別ASC-H和HSIL的患者。目前，ASC-H一般采用陰道鏡活檢確診，部分臨床醫(yī)師建議保守治療，定期復(fù)查，有可能延誤了最佳治療時(shí)間。

臨床上可采用宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查CDC7和PHH3蛋白的陽性表達(dá)情況，進(jìn)行早期篩查宮頸癌，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療。細(xì)胞分子生物學(xué)研究認(rèn)為，腫瘤發(fā)生的本質(zhì)上是由于細(xì)胞周期的調(diào)控紊亂，呈現(xiàn)出過度增殖和凋亡不足的狀態(tài)。隨著對細(xì)胞周期調(diào)控研究的不斷深入，多數(shù)學(xué)者認(rèn)同了腫瘤的發(fā)生多與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的觀點(diǎn)[8]。本研究結(jié)果顯示，CDC7和PHH3蛋白的陽性表達(dá)率均隨宮頸病變的嚴(yán)重程度而逐漸升高，表明CDC7和PHH3蛋白的表達(dá)情況可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

CDC7和PHH3蛋白均可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，CDC7是絲氨酸/蘇氨酸激酶，反映細(xì)胞周期中的S期，可調(diào)控微小染色體維持蛋白（minichromosome maintenance protein，MCM）的N端氨基酸磷酸化，磷酸化后的MCM可失活，并結(jié)合于染色質(zhì)上的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，啟動DNA復(fù)制過程，通過調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[9]。由于CDC7在所有轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞中均高表達(dá)，使其成為目前關(guān)于腫瘤研究的重要標(biāo)志物和靶點(diǎn)[10]。目前，國內(nèi)外的相關(guān)研究多集中于CDC7和PHH3蛋白在乳腺癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、肝癌和非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中的表達(dá)，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其與臨床療效及預(yù)后有一定關(guān)系。雖然，徐瑞云等[11]采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測子宮內(nèi)膜腺癌組織中CDC7mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中CDC7mRNA的表達(dá)水平明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織（P＜0.05）。但對于宮頸病變組織中CDC7和PHH3蛋白促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用機(jī)制及其與臨床特征的關(guān)系尚未明確。此外，部分宮頸病變的病理學(xué)診斷及鑒別非常困難，主要原因包括以下3個方面：①絕經(jīng)后女性的鱗狀上皮萎縮及CIN病變，尤其是高度的CIN病變；②宮頸腺體的鱗化及化生性增生與CIN病變；③嚴(yán)重的宮頸炎可能刺激上皮反應(yīng)性增生或掩蓋高度的CIN。因此，尋找更為準(zhǔn)確的標(biāo)志物量化、輔助病理學(xué)診斷，提高其診斷的準(zhǔn)確度至關(guān)重要。

本研究結(jié)果顯示，CDC7蛋白的陽性表達(dá)可能與宮頸癌臨床分期有關(guān)，與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分型和病理分級無關(guān)；PHH3蛋白的陽性表達(dá)可能僅與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。表明CDC7和PHH3蛋白可能與宮頸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，有望成為評估宮頸癌臨床進(jìn)展及預(yù)后的指標(biāo)。但本研究僅納入了10例宮頸腺癌患者，結(jié)果可能存在偏差，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入研究。

綜上所述，CDC7和PHH3蛋白的高表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，有望成為評估、預(yù)測宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。