扶正固本顆粒聯(lián)合順鉑對S180荷瘤小鼠T細胞免疫功能調節(jié)作用的研究

譚灝，楊偉晗，康永，劉聰，李祥

山西省中醫(yī)藥研究院，太原 0300120

惡性腫瘤已經成為中國重要的公共衛(wèi)生問題，自2010年來，惡性腫瘤已經超過心腦血管疾病，成為中國人群第一大死因。預計在未來幾十年內，中國惡性腫瘤的發(fā)病和病死人數(shù)將呈持續(xù)上升趨勢[1]。臨床上化療通常作為腫瘤治療的輔助手段，配合手術治療、放療應用。順鉑是典型的鉑類藥物之一，在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)順鉑化療后患者會出現(xiàn)免疫功能減退、骨髓抑制、食欲下降等一系列不良反應，這與中醫(yī)的正氣虛、脾氣虛所表現(xiàn)出的癥狀相似，此時應用中西醫(yī)結合療法往往可以獲得良好的療效[2-3]。扶正固本顆粒有良好的臨床療效基礎，由黃芩、淫羊藿、女貞子、何首烏等8味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、涼血解毒等功效，常用于放化療后氣陰兩虛兼熱毒癥合并用藥。本研究探討扶正固本顆粒聯(lián)合順鉑對荷瘤小鼠T細胞免疫功能的影響，旨在為扶正固本顆粒作為腫瘤化療輔助用藥的臨床應用提供實驗依據(jù)，以期加大其用藥范圍，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘤株 S180腹腔積液瘤瘤株購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2 動物 昆明種小鼠120只，體重（10±2）g，雌雄各半，購自中國輻射防護研究院。

1.1.3 儀器 垂直凈化工作臺購自蘇州凈化設備有限公司，SC-3610低速離心機購自安徽中科中佳科學儀器有限公司，細胞培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，AXIO HAL100電子顯微鏡購自上海成貫儀器有限公司，血球計數(shù)板購自江蘇康健華醫(yī)療用品有限公司，流式細胞儀Cytomics FC 500（COULTER TQ-Prep工作站）購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 建立荷瘤小鼠模型 S180小鼠瘤株經腹腔接種方式傳代，連續(xù)傳代至第3代后，頸椎脫臼法處死后移入預先進行消毒的凈化工作臺上，腹部皮膚消毒后切開，暴露腹腔，抽取腹腔積液放入無菌試管中，用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，調整細胞密度至1×107/ml，每只小鼠右腋部皮下接種0.2 ml。每日觀察腫瘤生長情況，肉眼觀察及手觸判斷建模是否成功[4]。

1.2.2 動物分組及給藥 接種次日將荷瘤小鼠隨機分為6組：空白組，無任何處理；模型組：等體積蒸餾水灌胃；化療組：順鉑注射液（1 mg/kg）腹腔注射；低、中、高劑量組：順鉑注射液（1 mg/kg）腹腔注射聯(lián)合扶正固本顆粒（5.625、11.250、22.500 g/kg）灌胃給藥。每日給藥1次，共10天，全部建模完成，未見小鼠死亡。

1.2.3 小鼠生長情況的觀察 肉眼觀察各組小鼠的毛色、活動狀態(tài)，記錄體重變化及死亡情況。

1.3 觀察指標及評價標準

給藥前及給藥結束稱量小鼠體重，對比體重的增長程度。小鼠末次給藥后24 h脫頸椎處死，迅速剝取腫瘤、胸腺和脾臟并稱重，按下列公式計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。抑瘤率=（模型組平均腫瘤質量-給藥組平均腫瘤質量）/模型組平均腫瘤質量×100%，胸腺（脾臟）指數(shù)=胸腺（脾臟）質量（mg）/小鼠體重（g）×10。

末次給藥24 h后摘除眼球取血，收集血液，用流式細胞儀檢測荷瘤小鼠外周血中CD4+、CD8+、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、調節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）水平及 Th1/Th2、Th17/Treg 的比值變化。因實驗材料原因，此部分研究每組各抽取16只小鼠進行實驗。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計-軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠生長情況

除空白組外，各組荷瘤小鼠均出現(xiàn)不同程度的活動受限。模型組小鼠皮毛疏密及光澤程度與空白組比較無明顯變化；化療組小鼠瘤體縮小明顯，活動受限程度較模型組輕，但毛色暗淡，無光澤且皮毛稀疏；低、中、高劑量組小鼠毛色光亮，皮毛緊實，活動受限程度較模型組輕，較化療組重。實驗過程中未見小鼠死亡。

2.2 體重、瘤重、抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的比較

與模型組比較，化療組與低、中、高劑量組均能抑制小鼠的體重增長，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低、中、高劑量組小鼠體重增長均多于化療組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。化療組與低、中、高劑量組小鼠瘤重均小于模型組小鼠，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低、中劑量組小鼠瘤重均大于化療組小鼠，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。根據(jù)抑瘤率公式可計算出抑瘤率分別為化療組65.5%，低劑量組43.2%，中劑量組44.0%，高劑量組57.6%。化療組與低、中劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中、高劑量組胸腺指數(shù)均高于化療組，低、中、高劑量組脾臟指數(shù)均高于化療組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 各組荷瘤小鼠體重增長、瘤重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的比較（±s）

表1 各組荷瘤小鼠體重增長、瘤重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的比較（±s）

注：a與模型組比較，P＜0.05；b與化療組比較，P＜0.05

組別空白組（n=20）模型組（n=20）化療組（n=20）低劑量組（n=20）中劑量組（n=20）高劑量組（n=20）F值P值體重增長（g）6.26±2.02 5.70±2.35-0.47±3.96a 1.99±1.40a b 3.14±2.52a b 4.77±2.39a b 27.134 26.029瘤重（g）—3.10±0.72 1.15±0.71a 2.21±0.93a b 2.14±0.58a b 1.34±0.40a 0.000 0.000胸腺指數(shù)31.90±7.23 28.48±3.49 15.05±2.55a 15.55±3.19a 16.48±4.93a b 21.08±3.29a b 9.489 1.533脾臟指數(shù)61.65±19.60 57.66±13.43 43.08±14.84a 46.99±17.35a b 48.36±16.73a b 58.03±13.33b 0.000 0.000

2.3 CD4+、CD8+水平的比較

與模型組比較，化療組小鼠血液中CD4+水平降低，CD8+水平提高，低劑量組小鼠CD8+水平提高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與化療組比較，中、高劑量組CD4+水平均提高，CD8+水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 各組荷瘤小鼠CD4+、CD8+水平的比較（%，±s）

表2 各組荷瘤小鼠CD4+、CD8+水平的比較（%，±s）

注：a與模型組比較，P＜0.05；b與化療組比較，P＜0.05

組別空白組（n=16）模型組（n=16）化療組（n=16）低劑量組（n=16）中劑量組（n=16）高劑量組（n=16）F值P值CD4+31.13±9.12 30.86±9.26 25.70±3.68a 26.00±5.42 28.79±5.35b 29.44±7.34b 4.423 7.039 CD8+25.57±4.25 27.85±5.61 36.66±6.54a 35.23±6.14a 31.08±6.44b 29.99±4.77b 0.001 0.000

2.4 外周血中Th1、Th2、Th17、Treg水平的比較

與模型組比較，化療組小鼠外周血中Th1、Th17水平均降低，Treg水平提高，低、中劑量組小鼠外周血中Th1、Th17水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與化療組比較，中、高劑量組小鼠外周血中Th1、Th17水平均提高，高劑量組Th2、Treg水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表 3）

表3 各組荷瘤-小鼠外周血中Th1、Th2、Th17、Treg水平的比較（%，x±s）

2.5 外周血中Th1/Th2、Th17/Treg的比較

與模型組比較，化療組與低、中、高劑量組小鼠外周血中Th1/Th2均降低，化療組與低、中劑量組Th17/Treg均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與化療組比較，低、中、高劑量組小鼠外周血中Th1/Th2均提高，高劑量組Th17/Treg水平提高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表4）

3 討論

腫瘤患者在進行化療時需要營養(yǎng)支持，若沒有足夠的營養(yǎng)支持，一定程度上會成為死亡原因[5]。除了危重患者需要靜脈營養(yǎng)支持，在中國傳統(tǒng)醫(yī)學的觀念中，經過口-消化道攝取營養(yǎng)是對人體最好的，所以扶正固本顆粒能在一定程度上改善因營養(yǎng)攝取不足而導致病情惡化的情況。作為動物免疫系統(tǒng)的第一道防線，脾臟和胸腺的重量及免疫器官指數(shù)是反映實驗動物的非特異性免疫與特異性免疫的最基本指標[6]，免疫功能減退小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯低于正常小鼠。本實驗結果提示扶正固本顆粒聯(lián)合順鉑能提高荷瘤小鼠胸腺及脾臟指數(shù)，增強機體的免疫功能。CD4+是一類輔助性T細胞，活化后可釋放大量細胞因子，對細胞免疫起正調節(jié)作用，CD8+T細胞又被稱為抑制性T細胞，對細胞免疫起負調節(jié)作用[7-8]。本實驗結果提示中、高劑量扶正固本顆粒聯(lián)合順鉑能提高荷瘤小鼠CD4+水平，降低CD8+水平，反映中、高劑量扶正固本顆粒有利于動物體內T細胞亞群增殖，以提高整體T細胞免疫功能。CD4+T細胞是重要的Th細胞，在免疫反應的不同階段都會有CD4+T細胞的參與，根據(jù)其分泌細胞因子不同，可以分為Th1和Th2細胞亞群，Th1主要參與細胞免疫，通過分泌白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），介導細胞毒性T細胞反應，提高免疫應答；Th2細胞主要分泌IL-2、IL-6、IL-10等，主要參與體液免疫，起到免疫抑制作用。當機體處于Th2細胞因子優(yōu)勢下，往往成為腫瘤免疫逃逸的原因。Th17細胞主要通過分泌IL-17、TNF-α活化中性粒細胞，并有研究表明，Th17細胞通過募集Th1細胞發(fā)揮抗腫瘤效應[9]。Treg細胞是一群具有免疫抑制作用的細胞群，Treg細胞數(shù)量增多也會增大腫瘤免疫逃逸的機會[10]。荷瘤小鼠外周血中Th1/Th2、Th17/Treg平衡被打破，優(yōu)勢傾向Th2、Treg一方，說明小鼠免疫功能被抑制，而這種抑制會導致腫瘤免疫逃逸的發(fā)生。本實驗中，高劑量扶正固本顆粒聯(lián)合順鉑能提高Th1/Th2、Th17/Treg比值。

表4 各-組荷瘤小鼠外周血中Th1/Th2、Th17/Treg的比較（x±s）

綜上所述，扶正固本顆粒能改善S180荷瘤小鼠化療后所出現(xiàn)的免疫抑制并有效改善食欲不振、體重減輕等常見不良反應。