大環(huán)糊精的分離、鑒定及應(yīng)用研究進(jìn)展

王金鵬 ，夏柳溪 ，孟令儒 ，金征宇 ，范天銘

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122；4.牧羊集團(tuán)有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225127）

環(huán)糊精（Cyclodextrins，CD），是由 D-吡喃葡萄糖單元通過α-l，4糖苷鍵首尾相連的環(huán)狀化合物的總稱。常見的有6、7和8個(gè)葡萄糖單元的分子，分別稱為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精。大環(huán)糊精（cycloamylose，CA）屬于環(huán)糊精的一種，之所以稱之為大環(huán)糊精，是因?yàn)樗木酆隙韧ǔＴ?以上[1]。較大的聚合度使大環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)不同于常見環(huán)糊精的中空桶狀結(jié)構(gòu)，大環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)具有彈性、柔性和扭曲性，當(dāng)聚合度足夠大時(shí)，大環(huán)糊精會(huì)呈現(xiàn)出雙環(huán)的空腔結(jié)構(gòu)[2-5]，結(jié)構(gòu)見圖1。這些特殊的結(jié)構(gòu)賦予了大環(huán)糊精高水溶性、低粘度等優(yōu)良特性，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖1 通過X-射線衍射得到的大環(huán)糊精的構(gòu)象模型Fig.1 Large-cyclodextrin Conformation from X-ray

大環(huán)糊精主要由酶法催化淀粉制備而得。酶的來源不同，其催化制備所得大環(huán)糊精的產(chǎn)率和聚合度范圍也具有較大差異，雖然人們對(duì)于制備某一特定聚合度的大環(huán)糊精進(jìn)行了諸多嘗試和探索，但目前為止，酶法制備所得大環(huán)糊精多為一定聚合度范圍大環(huán)糊精的混合物，這不僅對(duì)進(jìn)行大環(huán)糊精的包埋及應(yīng)用等方面的研究造成很大的困擾，而且限制了大環(huán)糊精工業(yè)化進(jìn)程。

1 大環(huán)糊精的分離

1.1 鏈狀和環(huán)狀糊精的分離

酶催化淀粉制備大環(huán)糊精的產(chǎn)物不僅含有大環(huán)糊精，而且含有常見環(huán)糊精、鏈狀糊精及低聚麥芽糖等。因此分離大環(huán)糊精的第一步，是去除非環(huán)狀的組分。由于大環(huán)糊精不具備還原末端，不能被β-淀粉酶、異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等識(shí)別末端的淀粉酶類降解，因此將這些酶用于催化大環(huán)糊精產(chǎn)物，即可使鏈狀分子降解，從而使得環(huán)狀組分得到初步純化。

許燕等人[6]利用異淀粉酶和4-α糖基轉(zhuǎn)移酶協(xié)同催化淀粉制備大環(huán)糊精。酶促反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入糖化酶作用一段時(shí)間，此時(shí)鏈狀分子即被降解為葡萄糖，后升溫使其在沸水浴的條件下維持至使糖化酶失活，然后利用無水乙醇對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行沉淀，在一定的乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，大環(huán)糊精可形成結(jié)晶沉淀析出，而葡萄糖不能析出，此時(shí)經(jīng)離心分離即可得到大環(huán)糊精。Ueda等人[7]則采用淀粉酶類（葡萄糖淀粉酶類和支鏈淀粉酶）將未成環(huán)的糊精降解成極限糊精或葡萄糖，然后利用酵母發(fā)酵消耗這些糊精或葡萄糖，再通過有機(jī)溶劑選擇性沉淀除去α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精，剩下的就是聚合度不等的大環(huán)糊精。

上述方法僅用于鏈狀和環(huán)狀糊精的分離，分離得到的大環(huán)糊精為一定聚合度范圍的大環(huán)糊精混合物，如果需要得到某一特定聚合度的大環(huán)糊精，則需要進(jìn)一步的分離大環(huán)糊精混合物，通常需要采用多級(jí)色譜分離技術(shù)。

1.2 薄層色譜（TLC）法

薄層色譜是常用的分離方法，方法簡單易行，但在糖的分離分析中，TLC所用常規(guī)的硅膠板僅用于單糖及低聚糖的分離。有報(bào)道表明[8]，用TLC能夠較好地將聚合度17以下的大環(huán)糊精進(jìn)行分離，此時(shí)分離所用薄板是經(jīng)氨基修飾的NH2-Kieselgel薄板，二氧己環(huán)與氨鹽水溶液作為展開劑，用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇硫酸溶液顯色，兩次展開，獲得較好的分離效果[9]。此外，楊成等人[10]在制備大環(huán)糊精（DP 11～15）時(shí)，利用 Bio-Gel P-4（Fine，45～90 μm）柱層析對(duì)大環(huán)糊精進(jìn)行分離，柱層析所用硅膠為200～300目的硅膠填料，分離得到的大環(huán)糊精的純度在90%左右。

1.3 高效液相色譜（HPLC）法

HPLC分離大環(huán)糊精，關(guān)鍵因素在于色譜柱和流動(dòng)相的選擇。淀粉經(jīng)催化后產(chǎn)生的大環(huán)糊精和低聚糖混合物，需要采用凝膠柱進(jìn)行分離，收集大環(huán)糊精組分，再采用反相ODS柱對(duì)其分離。如Koizumi等人[11]使用 ODS 柱（YMC-pack A-323-3，250x10 mm）對(duì)大環(huán)糊精進(jìn)行分離，采用體積分?jǐn)?shù)3%和4%的甲醇洗脫可分別分離得到聚合度10～11和12～20的大環(huán)糊精；采用體積分?jǐn)?shù)6%的甲醇洗脫時(shí)可分離得到聚合度21～31的大環(huán)糊精。 Endo等人[12-14]在分離聚合度18-21的大環(huán)糊精時(shí)，先選用制備型的氨基柱 （Asahipak ODS-5251-SS），以體積分?jǐn)?shù)6%的甲醇作為洗脫液對(duì)其進(jìn)行分離，然后利用氨基柱進(jìn)行分離，用體積分?jǐn)?shù)58%的乙腈作為洗脫液可分別分離得到單一聚合度的大環(huán)糊精。Taira等人[15]選擇ODS和氨基柱聯(lián)合使用，分別以體積分?jǐn)?shù)6%、8%甲醇和50%乙腈作為洗脫液，可分離得到聚合度36～39的大環(huán)糊精。

1.4 高效陰離子色譜（HPAEC）法

HPAEC是用的較多的分離分析大環(huán)糊精方法，該方法是利用離子交換色譜原理，使不同聚合度大環(huán)糊精經(jīng)Carbo-Pac-100色譜柱分離后被洗脫的先后順序不同，通過檢測其在溶液中電離質(zhì)子釋放出的電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同聚合度大環(huán)糊精進(jìn)行分離分析。 Koizumi等人[11]分別采用CarboPac-1和CarboPac-100對(duì)聚合度9～31的大環(huán)糊精和聚合度高至80的大環(huán)糊精進(jìn)行分離分析，分離常用的緩沖液為150 mmol/L的氫氧化鈉和150 mmol/L帶有200 mmol/L硝酸鈉的氫氧化鈉溶液作為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫。

1.5 毛細(xì)管電泳（CE）法

毛細(xì)管電泳具有較高的靈敏度和較短的分析時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。Kim等人[16-18]利用環(huán)糊精可以與芳香類物質(zhì)形成復(fù)合物，在紫外條件下有吸收的原理，對(duì)聚合度6～13的環(huán)糊精進(jìn)行了分析和表征。作者利用此原理使得聚合度22～50的大環(huán)糊精與碘等形成復(fù)合物，在毛細(xì)管電泳上分離[19]。運(yùn)行緩沖液為：0.6 mmol/L 的 I2、3.6 mmol/L KI、80 mmol/L 磷酸緩沖液、pH 5.1，分離電壓10 kV、分離溫度20℃，分離時(shí)交替采用0.5 mol/L HCl、超純水、1 mol/L NaOH浸潤10 min，然后用電極緩沖液浸潤5 min后啟動(dòng)上樣程序，上樣時(shí)間8 s，壓力0.8 Pa；檢測496 nm下的吸收光譜圖。 Endo等人[20]利用此方法對(duì)可能含有聚合度6～17的大環(huán)糊精和幾種藥物的混合物進(jìn)行分析，淀粉、線性的α-1，4葡萄糖可以直接被檢測出來，大環(huán)糊精混合物因濃度過低未被檢測出來。

2 大環(huán)糊精的鑒定

2.1 比色法

大環(huán)糊精因聚合度較大，具有類似淀粉的性質(zhì)，能夠與碘包合形成包合物，該包合物具有一定的吸光特性，且其吸光特性與底物的吸光特性有較大的差異，從而能夠?qū)崿F(xiàn)大環(huán)糊精產(chǎn)物的鑒定。因此常利用此原理衍生出的比色法作為檢測相關(guān)酶酶活的簡便方法。Wang等人[21]采用單波長分光光度法（SWC）測定4α-糖基轉(zhuǎn)移酶的總酶活和環(huán)化活性。作者研究發(fā)現(xiàn)淀粉-碘復(fù)合物會(huì)對(duì)大環(huán)糊精的檢測造成一定程度的干擾，進(jìn)而將單波長比色法延伸，開發(fā)了三波長分光光度法（TWC）和正交函數(shù)比色法（OFC），此方法比相比于單波長及雙波長法測定精確度高、適應(yīng)性強(qiáng)，精確度和回收率較高。

2.2 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS）

MALDI-TOF-MS用于鑒定大環(huán)糊精，具有分辨率高、檢測靈敏等優(yōu)點(diǎn)，通過解析分子離子峰的質(zhì)核比，計(jì)算可得大環(huán)糊精產(chǎn)物中的主要組分的聚合度。 Koizumi等人[11]用Vision 2000反射式的陽離子模式的 TOF（Thermo Bioanalysis，UK）對(duì)產(chǎn)物大環(huán)糊精進(jìn)行鑒定，離子化過程使用337 nm的氮激光脈沖持續(xù)時(shí)間為5 ns，2，5-二羥基苯甲酸 （10 mg/mL）作為基質(zhì)，加速電壓為5 kV，反射電壓為7 kV。MALDI-TOF采用6～10的單激光發(fā)射，將基質(zhì)溶液（0.5 μmL）與樣品溶液（1 mg/mL，0.5 μmL）進(jìn)行混合，在干空氣的條件下進(jìn)行質(zhì)譜分析。作者采用TOF-MS鑒定了制備的 LR-CD，測定所得相對(duì)分子質(zhì)量符合M+2Na-2[19]。

2.3 核磁共振和X-射線衍射法

上述鑒定方法僅能得到大環(huán)糊精的聚合度信息，無法分析得到大環(huán)糊精具體的結(jié)構(gòu)信息。Gessle[22]等人先采用HPLC的方法分離得到CD26，并利用37.5%的PEG400使其結(jié)晶，采用特殊的方法使2分子的CD26含有76.5個(gè)水分子，并將其中的595個(gè)原子固定，調(diào)整分辨率，采用核磁共振、X-射線衍射和人工模擬的方法對(duì)大環(huán)糊精（CD26）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，表征了大環(huán)糊精結(jié)構(gòu)中扭曲的結(jié)構(gòu)連接點(diǎn)，并指出CD26擁有兩個(gè)螺旋環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且都是左手螺旋，葡萄糖單元上2位O與鄰近葡萄糖單元上3位O之間可形成分子內(nèi)氫鍵，6位O與第6個(gè)葡萄糖單元上的2位或3位O之間形成分子內(nèi)氫鍵以維持其空腔，空腔內(nèi)存在一些無序水分子，在扭曲處，葡萄糖單元上3位O與鄰近葡萄糖單元上5位和6位O之間形成分子內(nèi)氫鍵，從而維持該扭曲結(jié)構(gòu)，總的來說CD26的雙螺旋結(jié)構(gòu)和V型淀粉的結(jié)構(gòu)相似。

3 大環(huán)糊精的應(yīng)用

與其它環(huán)糊精相比較，大環(huán)糊精具有極強(qiáng)的水溶性、較大的疏水空腔和特殊的柔性結(jié)構(gòu)，因此具有較強(qiáng)的包埋特性，特別是包埋一些相對(duì)分子質(zhì)量較大的客體。經(jīng)大環(huán)糊精的包埋，這些客體分子的溶解性和穩(wěn)定性會(huì)增大、分子的化學(xué)反應(yīng)性能也會(huì)有所變化。在食品領(lǐng)域中，大環(huán)糊精常常被用作淀粉的回生抑制劑、食品風(fēng)味的緩釋劑、食品中不良雜味的祛除劑，同時(shí)，還可以改變食品的流變學(xué)特性、增加食品的營養(yǎng)價(jià)值。在醫(yī)藥領(lǐng)域，大環(huán)糊精可以將布洛芬、氟比洛芬等各種藥物包埋從而增加藥物的穩(wěn)定性，提高藥物的利用率[23-24]。

3.1 低聚合度大環(huán)糊精

通常將聚合度小于10的大環(huán)糊精稱之為低聚合度的大環(huán)糊精。 Furuishi等人[25]發(fā)現(xiàn)CD9能夠?qū)70增溶，聚合度為10的大環(huán)糊精對(duì)維生素B具有良好的包埋效果，且容易實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。該團(tuán)隊(duì)同時(shí)還研究了CD9對(duì)不同客體分子的包埋情況，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，CD9對(duì)藥物地辛高和安體舒有包埋作用且有增溶效果，其增溶能力好于α-環(huán)糊精，但不如β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精。

3.2 中等聚合度大環(huán)糊精

通常將聚合度在10～50范圍內(nèi)的大環(huán)糊精稱之為中等聚合度的大環(huán)糊精，此類大環(huán)糊精主要用于包埋一些小分子的客體分子。

Larsen等人[26]采用毛細(xì)管電泳法，用聚合度10～17的大環(huán)糊精包埋一些小分子風(fēng)味物質(zhì)，如：丁基-苯甲酸和布洛芬等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聚合度為14的大環(huán)糊精與丁基-苯甲酸的包埋常數(shù)是α-環(huán)糊精的1/3，是 γ-環(huán)糊精的1/2；聚合物 14～16的大環(huán)糊精對(duì)布洛芬的包埋常數(shù)與α-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精的包埋常數(shù)大小相差不大。Fukami等人[27]研究表明聚合度大于22的環(huán)糊精混合物對(duì)碳鏃C60具有良好的增溶性。

Kitamura等人[28]采用等溫定量熱的方法研究了聚合度21～32的大環(huán)糊精與碘的包埋作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述聚合度的大環(huán)糊精與碘以1∶2的比例形成包合物，但是包合會(huì)導(dǎo)致大環(huán)糊精分子的靈活度下降，所以體系熵值大幅度降低。Mun等人[29]采用等溫滴定量熱的方法研究了聚合度24～44的大環(huán)糊精的包埋情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此范圍內(nèi)的大環(huán)糊精與SDS的包合能力很強(qiáng)，且包合過程伴隨放熱反應(yīng)。 另有研究表明聚合度22～45的大環(huán)糊精能夠促進(jìn)蛋白折疊，對(duì)膽固醇、地高辛、硝酸甘油、制霉菌素等具有較好的穩(wěn)定性和增溶特性[30，32]。

3.3 高聚合度大環(huán)糊精

通常將聚合度大于50的大環(huán)糊精稱之為高聚合度的大環(huán)糊精，此類大環(huán)糊精主要用于包埋相對(duì)分質(zhì)量更大的客體分子。

Takaha等人[31]研究表明，聚合度大于50的環(huán)糊精可以對(duì)醇類、脂肪酸類進(jìn)行包埋。Kitamura等人[28]研究了高聚合度的大環(huán)糊精可以與丁醇、辛醇和油酸等形成包合物，可以使得8-anlino-naphthalene硫酸的熒光性增強(qiáng)。此外，吳宗帥等人[33]利用相溶解度法證實(shí)了大環(huán)糊精對(duì)染料木苷有增溶的效果，同時(shí)證實(shí)了有包合物的形成，并且隨著大環(huán)糊精濃度的增加染料木苷的溶解度也增加。Taira等人[34]研究表明，大環(huán)糊精因?yàn)椴痪哂羞€原末端，通?？梢员苊獗煌馇械矸勖溉缙咸烟堑矸勖阜纸?，因此可以作為其他酶的包合物。Takaha等人[35]研究表明，大環(huán)糊精可以提高許多酶或微生物的反應(yīng)速率，如脂的水解、脂肪酸的合成和膽固醇的氧化等，Vander Maarel等人[36]已經(jīng)將大環(huán)糊精應(yīng)用到化妝品中，大環(huán)糊精的加入可以控制對(duì)皮膚有刺激作用，增加化妝品的透明感，避免體系的水油分離的現(xiàn)象。

4 結(jié)語

大環(huán)糊精因其聚合度的不同而大小不一，結(jié)構(gòu)各異，但其較大疏水柔性空腔結(jié)構(gòu)可用于包合成分復(fù)雜特別是大分子的物質(zhì)。由于大環(huán)糊精具有較高的水溶性、低粘度和不回生的特性，在食品、化工、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。但是，大環(huán)糊精的制備和分離的過程還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，單一聚合度大環(huán)糊精的分離無法在工業(yè)規(guī)模中實(shí)現(xiàn)，但不同聚合度的大環(huán)糊精混合物所表現(xiàn)出的良好包埋優(yōu)勢為大環(huán)糊精的應(yīng)用提供了一個(gè)新的方向，即采用方便快速的方法實(shí)現(xiàn)鏈狀和環(huán)狀糊精的分離，并將不同聚合度大環(huán)糊精混合物用于客體分子的包埋過程，這樣能夠更快的促使大環(huán)糊精的規(guī)模化生產(chǎn)，滿足市場對(duì)大環(huán)糊精需求。