檸檬苦素降解菌C6降解特性及活性降解酶的分離純化

張錦華 ，臧三麗 ，白寶清 ，岳建偉 ，范三紅

（1.山西大學生命科學學院，山西太原 030006；2.山西眾智檢測科技有限公司，山西太原 030006）

苦味問題一直是柑橘汁加工工業(yè)中亟待解決的關鍵性難題。有研究表明，檸檬苦素和柚皮苷是在柑橘類果汁生產中產生苦味的主要物質[1-4]。其中，檸檬苦素的苦味閾值很低，在水溶液中為1.0 mg/L，在果汁中約為3.4 mg/L，是柚皮苷苦味的20倍，且是引起果汁加工過程中產生后苦味的主要因素[5-6]。因此，研究改善檸檬苦素苦味的方法顯得尤為重要。

檸檬苦素是一種三萜類植物次生代謝產物，主要存在于蕓香科和楝科中[5]，在柑橘屬植物中含量最為豐富，是柑橘加工中產生苦味的主要物質[7]。有研究表明，檸檬苦素在柑橘果實中的含量較少，但由于柑橘果實中含有大量的檸檬苦素前體物質——非苦味的檸檬苦素A環(huán)內酯（LARL）[5，8]，在食品加工過程中采用的酸性、冰凍等條件下，LARL在檸檬苦素D環(huán)內酯水解酶的催化下迅速轉化為具有強烈苦味的檸檬苦素，從而導致柑橘汁產生后苦或延遲苦味的現(xiàn)象[4，9-12]。因此，降低加工后柑橘類果汁中的檸檬苦素含量是解決苦味現(xiàn)象的重要前提。

目前，脫除檸檬苦素等苦味物質的方法主要分為物理法和生物法，其中，物理脫苦法主要包括吸附脫苦、膜分離脫苦、超臨界CO2脫苦、屏蔽法脫苦和添加苦味抑制劑脫苦等；生物脫苦法主要是通過酶或微生物來降解柑橘果汁苦味成分，從而達到脫苦的目的，主要包括酶法脫苦、固定化細胞脫苦和基因工程脫苦等[13-19]，酶法脫苦具有專一性強、效果好、風味和營養(yǎng)成分無破壞、成本低等優(yōu)點，是目前主要的研究趨勢[20]。文獻報道中相關的脫苦酶主要有檸檬苦素D環(huán)內酯水解酶、檸檬苦素A-環(huán)內酯脫氫酶、檸檬苦素環(huán)氧酶、檸檬苦素醇脫氫酶等[21-24]，這些酶可以將檸檬苦素轉化為檸檬苦醇、檸檬苦酸和17-脫氫檸檬苦素類A-環(huán)內酯[25-26]。但上述這些酶最適的作用條件均為堿性，在酸性環(huán)境中的活性降低，而在實際應用中常因果汁的低pH值而使酶失活，且生產成本高，不適合工業(yè)化需求。

為提供并豐富實際果汁加工過程中優(yōu)質高效的脫苦酶來源，從生物脫苦的角度出發(fā)，前期試驗從酸性的釀醋醋醅中篩選得到1株高效降解檸檬苦素的微生物菌株解鳥氨酸拉烏爾菌C6（Raoultella ornithinolytica），本研究對C6的降解特性及條件進行了研究，并對其分泌的檸檬苦素降解酶進行了分離純化，以期為該菌及其酶系在柑橘汁的脫苦應用提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株為檸檬苦素降解菌株解鳥氨酸拉烏爾菌 C6（Raoultella ornithinolytica），保存于山西大學生命科學學院微生物實驗室。

1.2 試劑與儀器設備

1.2.1 試劑和培養(yǎng)基 檸檬苦素標準品（純度≥98%）購自上海金穗生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

無機鹽液體培養(yǎng)基：MgSO45 g，K2HPO410 g，KCl 5 g，KNO33 g，NaCl 2 g，檸檬苦素 6 mg，酵母膏1 g，蒸餾水 1 000 mL，以 HCl調 pH 值為 4.0（檸檬苦素質量濃度為6 mg/L）。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值自然（液體培養(yǎng)基中不加瓊脂）。

酶反應溶液：MgSO45 g，K2HPO410 g，KCl 5 g，KNO33 g，NaCl 2 g，檸檬苦素 6 mg，溶解于 1 000 mL的pH值為4.0的檸檬酸緩沖液中。

染色液（1 L）：1.0 g考馬斯亮藍 G-250，250 mL異丙醇，100 mL冰醋酸，650 mL蒸餾水。

脫色液（1 L）：50 mL乙醇，100 mL冰醋酸，850 mL蒸餾水。

1.2.2 儀器設備 SW-CJ-2FD型潔凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；HRHPY-300恒溫培養(yǎng)搖床，青島海爾特種電冰柜有限公司；HRSP-250H生化培養(yǎng)箱，青島海爾特種電冰柜有限公司；BL-75型立式壓力蒸汽滅菌筒，上海東亞壓力容器制造有限公司；JA1203N電子天平，上海精密科學儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-III型循環(huán)水真空泵，上海知信實驗儀器技術有限公司；UV-2800型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；GZX-9023MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SB25-12DTDN型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；離子交換層析柱（2.6 cm×20 cm）、凝膠過濾層析柱（1.6 cm×50 cm）、透析袋（截留分子量6～14 ku），上海華美生物公司；GIS-2009電泳凝膠成像系統(tǒng)，天能科技上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 解鳥氨酸拉烏爾菌C6對檸檬苦素降解特性

1.3.1.1 解鳥氨酸拉烏爾菌C6的生長曲線 挑取一環(huán)單菌落接入50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)12 h，制得種子液。將種子液以1%的接種量接入50 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，在600 nm處測定菌液的光密度值（OD600），繪制菌株生長曲線。

1.3.1.2 檸檬苦素降解曲線 將種子液以1%的接種量接入50 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，在600nm處測定菌液的光密度值（OD600），繪制菌株生長曲線，并測定培養(yǎng)基中檸檬苦素的含量，以不接菌的液體培養(yǎng)基為空白對照，計算解鳥氨酸拉烏爾菌C6對檸檬苦素的降解率，繪制降解曲線。

1.3.2 解鳥氨酸拉烏爾菌C6對檸檬苦素降解條件優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗 將解鳥氨酸拉烏爾菌C6的種子液以1%的接種量分別接種到50 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，考察種子液菌齡、底物檸檬苦素質量濃度、接種量和培養(yǎng)時間對檸檬苦素降解率的影響。

1.3.2.1.1 種子液菌齡對檸檬苦素降解率的影響檸檬苦素質量濃度6 mg/L，接種量1%，培養(yǎng)時間10 h，測定種子液菌齡為 6，8，10，12，14 h 時解鳥氨酸拉烏爾菌C6的檸檬苦素降解率。

1.3.2.1.2 檸檬苦素質量濃度對檸檬苦素降解率的影響 菌齡10 h，接種量1%，培養(yǎng)時間10 h，測定底物檸檬苦素質量濃度為 2，4，6，8，10 mg/L時解鳥氨酸拉烏爾菌C6的檸檬苦素降解率。

1.3.2.1.3 接種量對檸檬苦素降解率的影響 菌齡10h，底物檸檬苦素質量濃度6 mg/L，培養(yǎng)時間10 h，測定接種量為0.2%，0.6%，1.0%，1.4%，1.8%時解鳥氨酸拉烏爾菌C6的檸檬苦素降解率。

1.3.2.1.4 培養(yǎng)時間對檸檬苦素降解率的影響 固定菌齡10 h，接種量1%，底物檸檬苦素質量濃度6 mg/L，測定培養(yǎng)時間為 6，8，10，12，14 h 時解鳥氨酸拉烏爾菌C6的檸檬苦素降解率。

每組試驗重復3次，取平均值。

1.3.2.2 響應面優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗的結果，分別對每個因素選取低、中、高3個水平，利用試驗設計軟件Design-expert 8.06中的Box-Behnken設計方案，以解鳥氨酸拉烏爾菌C6對檸檬苦素降解率為響應值，采用4因素3水平的響應面分析法對降解條件進一步優(yōu)化。響應面試驗因素水平列于表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平

1.3.3 優(yōu)化條件下解鳥氨酸拉烏爾菌C6的降解速率 在最優(yōu)條件下，對不同培養(yǎng)時間下解鳥氨酸拉烏爾菌C6的檸檬苦素降解量進行測定，并計算檸檬苦素降解率。

1.3.4 檸檬苦素降解酶的分離純化

1.3.4.1 檸檬苦素降解酶粗酶液的提取 前期試驗表明，具有降解檸檬苦素活力的活性酶主要集中在發(fā)酵上清液中，屬于胞外酶，粗酶液的提取參考文獻[25]并略作改動：將菌株C6的種子液按1%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)物經3 500 r/min離心10 min除去菌體。取上清液加入硫酸銨至飽和度為80%，4℃靜置過夜，10 000 r/min離心10 min分離沉淀蛋白，收集沉淀物，用pH值4.0的檸檬酸緩沖液沖洗2次后，溶解并定容至5mL，即為制得的檸檬苦素降解酶粗酶液，采用考馬斯亮藍法測定其蛋白含量。

1.3.4.2 硫酸銨飽和度的確定 取離心后菌株的發(fā)酵上清液，在冰浴環(huán)境下，邊攪拌邊緩慢加入飽和度不相同的固體硫酸銨（10%～90%，每10%為一間隔），4℃過夜沉淀后，10 000 r/min離心 15 min，將沉淀用少量蒸餾水溶解，放置于透析袋中進行透析除鹽。分別測定各不同飽和度下的檸檬苦素降解酶活力和蛋白量，并繪制出硫酸銨沉淀曲線以確定硫酸銨沉淀的最適飽和度。

將發(fā)酵上清液以最適的硫酸銨飽和度沉淀后鹽析，4℃靜置過夜，10 000 r/min離心30 min，剔除上清液，將沉淀用少量蒸餾水溶解，放置于透析袋中充分透析除鹽24 h（中間每隔4 h換一次透析液），聚乙二醇濃縮后即可得到經過初步純化的粗酶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.3 Sephadex G-100凝膠過濾層析 Sephadex G-100凝膠柱（1.6 cm×50 cm）裝柱后，首先用0.02 mol/L，pH值為4.0的檸檬酸緩沖液平衡，然后把經過硫酸銨沉淀、透析脫鹽、濃縮后的粗酶液5 mL加到已平衡過的凝膠柱中，并用0.02 mol/L，pH值為4.0的檸檬酸緩沖液洗脫，流速為1 mL/min，用自動部分收集器每5 mL收集一管，采用紫外檢測儀于280 nm波長處進行檢測，跟蹤監(jiān)測蛋白質含量；根據(jù)洗脫曲線，收集每個洗脫峰，測定降解檸檬苦素的活性，確定具有降解檸檬苦素酶活性的目標峰并收集，合并后于4℃透析，用聚乙二醇濃縮至5 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.4 DEAE-纖維素離子交換層析 DEAE-纖維素離子交換柱（2.6 cm×20 cm）裝好后，預先用0.02 mol/L，pH值為4.0的檸檬酸緩沖液平衡，然后將經Sephadex G-100凝膠柱收集的活性峰濃縮后的樣品上樣（上樣量為1 mL），先用緩沖液洗脫至樣品完全吸附（洗滌未結合的雜蛋白至記錄儀顯示無蛋白隨平衡緩沖液流出），再用0～1 mol/L的NaCl溶液（緩沖液配制）進行線性梯度洗脫，流速為2 mL/min。利用自動部分收集器每5 mL收集一管，于280 nm波長處采用紫外檢測儀進行檢測，跟蹤監(jiān)測蛋白含量；根據(jù)洗脫曲線分別收集每個洗脫峰，測定并收集具有降解檸檬苦素活性的目標峰，合并后于4℃透析，濃縮，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.5 降解檸檬苦素酶純度鑒定及分子質量測定

采用SDS-PAGE垂直板電泳法[27]鑒定通過多步分離純化后的蛋白酶的純度并測定其相對分子質量。SDS-PAGE垂直板電泳采用分離膠質量分數(shù)為12%、電流強度為15 mA，濃縮膠質量分數(shù)為5%、電流強度為10 mA。電泳于3 h后停止，采用考馬斯亮藍G-250染色，脫色后拍照。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 檸檬苦素的含量測定 以高氯酸∶冰醋酸體積比為4∶5制得酸母液，取酸母液30 mL，加入1.11 g對二甲胺基苯甲醛，制得DMAB指示劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

準確吸取質量濃度為0.2 mg/mL的檸檬苦素標準溶液0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL于試管中，分別加甲醇（色譜純）至2.0 mL，再快速加入3 mL DMAB指示劑和3 mL酸母液，室溫放置30 min后，于470 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、檸檬苦素標準液的質量濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制檸檬苦素標準曲線。并求得回歸方程為y＝0.009 4x＋0.032 5（R2＝0.998 7），檸檬苦素質量濃度在0～0.20 g/L范圍內線性關系良好。

將培養(yǎng)后的反應體系經丙酮超聲提取后旋蒸至干，用10 mL甲醇定容。從中吸取2 mL樣液，快速加入3 mLDMAB指示劑和3 mL酸母液，室溫放置30 min后，以未接入菌種的無機鹽液體培養(yǎng)基作參比，在470 nm處測吸光度，依標準曲線求檸檬苦素的含量[25]；并按公式（1）計算檸檬苦素降解率。

式中，m1為對照中的檸檬苦素含量；m2為降解后樣品中殘余檸檬苦素含量。

1.4.2 檸檬苦素降解酶酶活力測定[25-26]取4支10 mL的EP管，設定1支對照管及3支測定管。每管加入1 mL酶反應溶液，然后各測定管加入1 mL待測酶液，對照管中加1 mL蒸餾水，反應10 min。將測定管和對照管分別沸水浴15 min以終止酶反應。冷卻后，用甲醇定容至10 mL，從中吸取2 mL樣液，分別快速加入3 mL DMAB指示劑和3 mL酸母液，室溫放置30 min后，在470 nm處測定吸光度，并根據(jù)檸檬苦素標準曲線求出4支EP管中檸檬苦素含量。每毫升酶液在酶反應條件下每分鐘所降解的檸檬苦素的微克數(shù)為一個酶活力單位。酶比活力是指在不同的影響因素下，各水平酶活力與最高酶活力的比值[28]。

式中，N為稀釋倍數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行分析，并用Origin Pro軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 降解特性研究

圖1表示檸檬苦素降解菌C6在以檸檬苦素為唯一底物的培養(yǎng)基中生長和降解檸檬苦素的情況。由圖1可知，0～2 h為該菌株的生長延滯期，從2 h開始進入對數(shù)生長期，12 h之后進入穩(wěn)定期。隨著菌株的生長，菌株對底物檸檬苦素的降解率也逐漸增加，在2～12 h內檸檬苦素降解能力明顯增加，后期趨于穩(wěn)定，且菌株的檸檬苦素降解曲線與其生長曲線的增長趨勢保持一致，推測該菌株的檸檬苦素降解能力可能與其生長量有關，即隨著生長量的增加其降解檸檬苦素的能力也逐漸增加，降解菌C6發(fā)揮作用的酶系可能為組成酶。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 種子液菌齡對檸檬苦素降解率的影響 從圖2可以看出，種子液菌齡對菌株C6的檸檬苦素降解能力有較大的影響，隨著菌齡的增加，菌株的檸檬苦素降解率也逐漸增加，當菌齡為8 h時，培養(yǎng)后菌株的檸檬苦素降解率達70%以上；當菌齡為10 h時，降解效果最佳，降解率為74.25%；此后降解率隨菌齡的延長而降低。因此，選擇的最佳菌齡為10 h，以達到最佳的效果，加快生物降解速率。

2.2.2 接種量對檸檬苦素降解率的影響 接種量的大小決定發(fā)酵過程中微生物的增長速度，適宜的接種量可以縮短發(fā)酵周期[29]。接種量對菌株C6降解檸檬苦素的影響如圖3所示，隨著接種量的增加，C6的檸檬苦素降解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當接種量為1%時，相應菌株的檸檬苦素降解率最高，達到83.47%，說明在該接種量下,菌株對檸檬苦素的利用效率最高；當接種量超過1%時，檸檬苦素降解率逐漸降低。故選擇的最佳接種量為1%。

2.2.3 底物檸檬苦素質量濃度對檸檬苦素降解率的影響 檸檬苦素質量濃度對菌株降解檸檬苦素的影響如圖4所示，隨著底物檸檬苦素質量濃度的增加，檸檬苦素降解率先升高后降低，在檸檬苦素質量濃度為0～4 mg/L時，檸檬苦素降解率呈現(xiàn)升高趨勢；在底物檸檬苦素添加量為4 mg/L時體系中菌株的降解率達到最大（85.26%）；當?shù)孜餀幟士嗨刭|量濃度超過4 mg/L時，菌體的降解能力反而減弱，可能是由于高質量濃度的底物對菌體的生長和作用起到一定的抑制作用。故選擇的最佳檸檬苦素質量濃度為4 mg/L。

2.2.4 菌種培養(yǎng)時間對檸檬苦素降解率的影響微生物的發(fā)酵都有其特定的發(fā)酵周期，發(fā)酵時間短不利于菌株中相應作用酶的合成，發(fā)酵時間過長菌體會發(fā)生自溶，同樣不利于發(fā)酵[30]。圖5結果表明，菌株在培養(yǎng)6 h后檸檬苦素降解率逐漸增加，并達到最佳培養(yǎng)時間段，即在培養(yǎng)12 h時，降解率達到80.61%；之后隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質不斷消耗，有毒代謝產物積累，菌體可能發(fā)生自溶或產物的反饋抑制作用，致使降解率逐漸降低。因此，選擇12 h作為最佳培養(yǎng)時間。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 檸檬苦素降解率的二次多項回歸方程 如表2所示，將菌齡、檸檬苦素質量濃度、接種量、培養(yǎng)時間作為研究條件，以檸檬苦素降解率為響應值，共得到29個試驗點，其中27個為析因點，1個為中心點，中心點試驗進行了5次，用來估計誤差。

通過Design-Expert 8.06軟件對表2的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得對檸檬苦素降解率（Y）的二次多項回歸方程為Y＝91.69＋0.18A＋0.64B－0.58C－0.079D－1.11AB－1.32AC－7.5×10-3AD＋1.15BC－0.32BD－0.30CD－2.91A2－1.69B2－2.41C2－1.55D2，對該回歸模型及系數(shù)進行顯著性檢驗，其結果列于表3。

2.3.2 回歸模型的方差分析 對回歸數(shù)學模型進行方差分析，以檢驗方程的有效性和各因子的偏回歸系數(shù)，回歸模型的方差分析如表3所示。通過統(tǒng)計學分析可以發(fā)現(xiàn)，該試驗選用的模型極顯著（P＜0.000 1），方差的失擬項不顯著（P＝0.826 4＞0.05），說明模型的選擇是合適的。另外，模型調整確定系數(shù)R2Adj為0.806 9，說明模型能解釋80.69%響應值的變化，擬合程度較好。因變量與所考察自變量之間的復相關系數(shù)R2為0.903 4，說明該模型擬合程度較好，試驗誤差小，可用該回歸方程代替真實點對試驗結果進行分析。由表3還可知，各因素對檸檬苦素降解率影響程度的大小順序為：檸檬苦素質量濃度＞接種量＞菌齡＞培養(yǎng)時間。同時，表3結果還顯示，在此試驗設計中，B，C，AB，AC，BC項顯著（P＜0.05），A2，B2，C2，D2項均為極顯著（P＜0.01）。

表2 響應面試驗設計與結果

表3 方差分析

2.3.3 最佳降解條件的確定 根據(jù)回歸模型，得出檸檬苦素降解率取最高值的各因素的優(yōu)化組合為菌齡10.05 h，底物檸檬苦素質量濃度4.29 mg/L，接種量0.96%，培養(yǎng)時間12.04 h，在此條件下，檸檬苦素降解率的理論最高值為91.77%?？紤]到實際操作的可行性，將培養(yǎng)條件調整為菌齡10 h，檸檬苦素質量濃度為4 mg/L，接種量1%，培養(yǎng)時間為12 h，在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗，結果表明，菌株C6的檸檬苦素降解率為91.28%±0.17%，與理論值（91.77%）接近，說明該試驗模型可以較好地預測優(yōu)化檸檬苦素降解菌的培養(yǎng)條件，具有實際應用價值。

2.4 最優(yōu)條件下菌株C6的檸檬苦素降解速率分析

試驗進一步考察了菌株C6在優(yōu)化培養(yǎng)條件下12 h內降解檸檬苦素的速率（圖6）。由圖6可知，最優(yōu)條件下，將菌齡10 h的菌株以1%的接種量加入到底物檸檬苦素質量濃度為4 mg/L的培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)基中檸檬苦素含量的減少量來表征菌株對檸檬苦素的降解速率，相比在培養(yǎng)時間為0～9 h培養(yǎng)基中檸檬苦素含量緩慢降低；培養(yǎng)9～11 h時檸檬苦素含量急劇下降?？梢姡闏6培養(yǎng)9 h后對檸檬苦素的降解能力迅速增加，降解速率也隨著快速增加；11～12 h時降解速率趨于平緩。

2.5 檸檬苦素降解酶的分離純化

2.5.1 硫酸銨飽和度的確定 在發(fā)酵上清液中以不同的硫酸銨飽和度（10%～90%）沉淀粗酶液，測定其透析液的蛋白析出量，作硫酸銨飽和度—蛋白析出量曲線（圖7）。由圖7可知，在40%～80%飽和度范圍內，蛋白析出質量濃度隨硫酸銨的飽和度的增加而增加；當硫酸銨的飽和度大于80%時，蛋白析出量并沒有顯著增加。因此，選擇飽和度為80%的硫酸銨進行沉淀。

向上清液中加入飽和度為80%的硫酸銨，4℃靜置過夜，收集沉淀，透析，測定透析液的總酶活力為13 194 U，總蛋白質量為 217.64 μg（表 4）。

表4 檸檬苦素降解酶純化結果

2.5.2 Sephadex G-100凝膠過濾柱層析 將通過硫酸銨沉淀、透析脫鹽、濃縮后的蛋白樣品上SephadexG-100凝膠過濾柱，得到如圖8所示的洗脫曲線。

從圖8可以看出，上清液經凝膠過濾柱后出現(xiàn)2個明顯的洗脫峰，合并同一峰的洗脫液，濃縮后測定各個峰的蛋白含量和檸檬苦素降解活性，結果顯示，峰1中蛋白含量為0.02 g/L，降解檸檬苦素酶活力為19.47 U；峰2中蛋白含量為0.013 3 g/L，活性為172.94 U?？梢?，具有降解檸檬苦素能力的活性蛋白主要集中在峰2。

2.5.3 DEAE-纖維素柱層析 峰2濃縮后經DEAE-纖維素柱層析分離，對應的洗脫曲線如圖9所示，收集3個洗脫峰，合并后測定相應的蛋白含量和檸檬苦素降解活性，結果表明，蛋白質主要集中在9～42管，且在第16，37管出現(xiàn)2個活性峰，其中，第16管蛋白質含量最高，達到0.925 μg/mL；具有檸檬苦素降解活性的酶主要集中在第7～26管，經透析、濃縮后測定檸檬苦素降解酶活力為354.51 U，而35～42管為雜蛋白，不具有檸檬苦素降解活性。

2.5.4 酶純化結果 發(fā)酵上清液經硫酸銨鹽析、Sephadex G-100層析、DEAE-纖維素柱層析后，每一個純化步驟后所得到的酶比活力、純化倍數(shù)以及酶活力回收率如表所4所示。

由表4可知，粗酶液在經過3步分離純化操作后，酶的純化倍數(shù)為9.44倍，酶活力回收率35.13%，比活力為354.52 U/μg，純化效果明顯。

2.5.5 酶純度鑒定及分子量的測定 對純化后的檸檬苦素降解酶進行SDS-PAGE電泳試驗，結果如圖10所示，純化后的檸檬苦素降解酶在SDS-PAGE電泳上為單一條帶，達到了電泳純，其相對分子質量為27 ku左右。

3 結論與討論

本試驗對前期從醋醅中篩選出的菌株C6的降解特性進行了研究，明確了其生長量與降解檸檬苦素之間的關系，對檸檬苦素降解菌的生長周期測定可知，12 h之后進入穩(wěn)定期，生長曲線趨于平衡，其降解曲線與生長曲線總體趨勢保持一致。探討了菌齡、底物檸檬苦素質量濃度、接種量、培養(yǎng)時間等單因素對菌株降解檸檬苦素的影響，并在單因素基礎上，應用Box-Benhnken中心組合試驗和響應面分析法，確定了檸檬苦素降解菌的最優(yōu)發(fā)酵條件：菌齡10 h、檸檬苦素質量濃度4 mg/L、接種量1%、培養(yǎng)時間12 h，在此條件下，檸檬苦素降解率達到91.28%±0.17%，9 h以后降解速率迅速增加。采用硫酸銨沉淀、透析、濃縮、Sephadex G-100凝膠過濾層析、DEAE-纖維素柱層析對該菌株產生的檸檬苦素降解酶進行逐步純化，得到電泳純的檸檬苦素降解酶（相對分子質量為27 ku），純化倍數(shù)為9.44，比活力提高到354.52 U/μg，回收率為35.13%。

試驗填補了酸性環(huán)境中生物脫苦的應用空白，對檸檬苦素降解菌和相關酶系的特性進行了初步研究，經純化得到的檸檬苦素降解酶，其酶活力明顯高于目前文獻報道的D環(huán)內酯水解酶、檸酸A-環(huán)內酯脫氫酶、檸檬苦素環(huán)氧酶、檸檬苦素醇脫氫酶等的降解活性[21-24，31-35]，并且在酸性環(huán)境中具有顯著的降解優(yōu)勢，后期將對菌株C6檸檬苦素降解酶的作用機制和降解途徑進一步研究，并通過柑橘汁中的脫苦評價，以期提高該酶在實際生產上的適用性。