膝骨關(guān)節(jié)炎模型小鼠相關(guān)穴區(qū)微循環(huán)敏化的光聲成像觀察*

劉瀟瀟，丁 寧，姜 婧，陳寧波，趙煌旋，李志剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

“穴位敏化”是指腧穴從生理狀態(tài)下的“靜息態(tài)”轉(zhuǎn)變?yōu)椴±頎顟B(tài)下的“激活態(tài)”，從而實(shí)現(xiàn)接收刺激、調(diào)節(jié)機(jī)體狀態(tài)的功能[1],而“敏化態(tài)腧穴”作為疾病在體表的反映部位也具有重要的臨床價(jià)值[2-4]。目前關(guān)于穴位敏化的研究集中在腧穴的光敏化、電敏化、熱敏化及微循環(huán)敏化等方面[5]。而微循環(huán)作為人體臟器的重要結(jié)構(gòu)，在物質(zhì)供應(yīng)與代謝、維持血流灌注及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]，與腧穴敏化密切相關(guān)。腧穴微循環(huán)敏化主要表現(xiàn)為疾病狀態(tài)下，特定腧穴的皮膚局部微循環(huán)流量及血管通透性出現(xiàn)顯著改變[7-8]。

目前,腧穴敏化在組織微循環(huán)層次上的成像研究相對(duì)不足，不僅成像技術(shù)手段嚴(yán)重滯后且其特異性與精確度均處在較低水平，一定程度上制約了對(duì)腧穴敏化實(shí)質(zhì)的深入研究[9]。光聲成像技術(shù)(Photoacoustic imaging，PAI)是新一代國(guó)際先進(jìn)成像技術(shù)，其光學(xué)成像對(duì)比度高、對(duì)組織功能特性敏感，同時(shí)又具備了聲學(xué)成像的高探測(cè)深度與良好的深層組織空間分辨率，具有無(wú)損、活體、實(shí)時(shí)、多功能及跨尺度等優(yōu)勢(shì)[10]。此技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)一定深度范圍內(nèi)毛細(xì)血管水平的皮下微循環(huán)成像并能針對(duì)其結(jié)構(gòu)形態(tài)進(jìn)行量化評(píng)價(jià)，在微循環(huán)成像領(lǐng)域呈現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。

因此,本研究將PAI技術(shù)作為研究手段，進(jìn)行穴位敏化研究，以期將穴位敏化過(guò)程的特征性改變——局部微循環(huán)血管形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)呈現(xiàn)出來(lái)，以揭示腧穴內(nèi)涵，探究腧穴敏化的基礎(chǔ)性規(guī)律，從而為針灸臨床提供客觀依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠12只，雄性，(30.0±2.0)g/只，8周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心(批號(hào):SCXK(Jing)2016-0006)。小鼠被飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的隔離設(shè)施中，溫度(24±2)℃，12-H2黑暗/光明循環(huán)，無(wú)菌飲用水和標(biāo)準(zhǔn)顆粒食物可隨意獲得。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)7天。所有的實(shí)驗(yàn)程序都符合國(guó)家健康研究所制定的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理原則”的指導(dǎo)方針和中華人民共和國(guó)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和護(hù)理的立法。該實(shí)驗(yàn)方案獲得了北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 藥品

單碘乙酸鹽(Mono-iodo-acetic acid，MIA)(美國(guó)sigma公司)，異氟醚(日本W(wǎng)ako公司)，0.9%生理鹽水(中國(guó)OUBEI公司)，戊巴比妥鈉(美國(guó)sigma公司)，多聚甲醛(中國(guó)北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)，番紅固綠染液(中國(guó)谷歌生物科技有限公司)。

1.3 儀器

光聲顯微鏡(Optical-resolution Photoacoustic Microscopy，OR-PAM)(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院生物醫(yī)學(xué)與健康工程研究所，中國(guó));小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)公司，中國(guó));小動(dòng)物恒溫系統(tǒng)(奧爾科特生物科技有限公司，中國(guó));光學(xué)顯微鏡(Olympus Corporation公司，日本)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，12只雄性BALB/c小鼠被隨機(jī)分為3組：空白組(Control)、膝骨關(guān)節(jié)炎模型組(Knee Osteoarthritis Model，KOA)、假模型組(False Model，F(xiàn)M)，每組4只。

2.2 模型制備

采用膝關(guān)節(jié)注射單碘乙酸鹽(MIA)方法于實(shí)驗(yàn)第0天進(jìn)行小鼠KOA模型制備[11]。具體方法如下：用0.9%的無(wú)菌生理鹽水配制濃度為0.05 mg/μL的MIA溶液。腹腔注射戊巴比妥鈉(1%，30 mg/kg)將小鼠麻醉后，清理左后肢膝關(guān)節(jié)附近的鼠毛，將關(guān)節(jié)屈曲到最大限度后，用27G無(wú)菌注射器將10 μL配制好的MIA溶液經(jīng)小鼠左后肢膝髕韌帶外側(cè)向膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，經(jīng)14天后成模[11]。FM組用同樣的方法于左后肢膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入10 μL 0.9%的生理鹽水，Control組則不做任何處理。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 番紅固綠染色 于實(shí)驗(yàn)第14天，完成PAI檢測(cè)后，將各組小鼠腹腔注射戊巴比妥(150 mg/kg)致死。取左膝關(guān)節(jié)后用攝子和剪刀去除皮膚后固定于4%多聚甲醛溶液中2天，再將膝關(guān)節(jié)置于5%甲酸中進(jìn)行脫鈣10天，然后用酒精脫水后進(jìn)行石蠟包埋及切片。隨后將切片脫蠟、脫水并在1%固綠中染色1.5 min，然后用乙酸進(jìn)行區(qū)分。再將切片用0.5%番紅染色1.5 min，用乙醇區(qū)分，并用自來(lái)水洗滌。切片用二甲苯和中性膠固定后，在光學(xué)顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)改變。

2.3.2 PAI檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)第14天，運(yùn)用PAI系統(tǒng)對(duì)各組小鼠左后肢足三里、陽(yáng)陵泉及非穴區(qū)微循環(huán)血管彎曲度、直徑百分比及密度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)室室溫控制在(25±1)℃，相對(duì)濕度(55±10)%，風(fēng)速<1 m/s。于麻醉前24 h，對(duì)小鼠左后肢膝關(guān)節(jié)相關(guān)監(jiān)測(cè)區(qū)域進(jìn)行脫毛處理。用異氟醚和氧氣的混合物，以2%異氟醚的濃度用于誘導(dǎo)，1.5%用于維持(流速：300 mL/min)，在小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)中將小鼠麻醉。將小鼠至于PAI系統(tǒng)下，KOA相關(guān)穴區(qū)位于掃描區(qū)域的中心，將超聲凝膠涂抹在監(jiān)測(cè)區(qū)域皮膚和水膜之間用于超聲耦合。參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》進(jìn)行穴位定位，足三里位于膝關(guān)節(jié)下4 mm，脛骨前肌上脛骨前結(jié)節(jié)外側(cè)旁開(kāi)2 mm；陽(yáng)陵泉位于小鼠后肢的外側(cè), 在腓骨頭前下方的的凹陷處[12]；非穴位于足三里外下方旁開(kāi)3 mm，此位點(diǎn)沒(méi)有出現(xiàn)在穴位圖譜上而且周圍也沒(méi)有任何重要神經(jīng)[13-15]。根據(jù)小鼠的穴位定位，在光聲成像圖上定出足三里、陽(yáng)陵泉及非穴的相對(duì)位置。見(jiàn)圖1。儀器監(jiān)測(cè)參數(shù)為：常規(guī)分辨率，皮膚表面上的光能量密度保持約18 mJ/cm2(符合ANSI安全閾值要求ANSIZ136.3-2005)，掃描區(qū)域4.5 mm×6.5 mm。圖像監(jiān)測(cè)范圍為小鼠左后肢膝關(guān)節(jié)正側(cè)面，監(jiān)測(cè)穴區(qū)1 mm2范圍內(nèi)血管成像并記錄其光聲圖像。采用微血管定量分析算法(microvascular quantification algorthm)在Matlab軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 番紅固綠染色切片觀察

番紅固綠染色顯示：Control組軟骨基質(zhì)呈均勻的紅色，潮線清晰；FM組軟骨表面光滑，軟骨細(xì)胞排列整齊，軟骨層番紅染色均勻紅染。Control組和FM組軟骨表明及軟骨形態(tài)完整未顯示任何損傷。KOA組關(guān)節(jié)軟骨厚度明顯變薄，細(xì)胞排列較紊亂，軟骨侵蝕基質(zhì)流失，軟骨裂隙較多，染色淡且不均一，軟骨表層剝蝕并變形，中層囊腫形成。見(jiàn)圖1。

注：A：Control組，B：KOA組，C：FM組 (標(biāo)尺100 μm，20×)。

3.2 足三里、陽(yáng)陵泉、非穴穴區(qū)的PIA圖及微循環(huán)結(jié)構(gòu)的定量分析

3.2.1 小鼠左后肢4.5 mm× 6.5 mm區(qū)域內(nèi)的PIA圖 見(jiàn)封三彩圖2～3和圖4。

3.2.2 各組微血管彎曲度比較 微血管彎曲度包含距離度量(Distance metric，DM)、彎曲計(jì)數(shù)度量(Inflection count metric，ICM)和角度度量(Sumofangles metric，SOAM)。實(shí)驗(yàn)第14天，PAI系統(tǒng)顯示各組的足三里、陽(yáng)陵泉、非穴穴區(qū)之間，微血管彎曲度無(wú)顯著差異。KOA組與Control組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),Control組與FM組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

3.2.3 各組微血管直徑百分比比較 微血管的直徑范圍是10～100 μm，在足三里、陽(yáng)陵泉及非穴局部直徑范圍主要為20～60 μm。實(shí)驗(yàn)第14天，PAI系統(tǒng)顯示各組的足三里、陽(yáng)陵泉、非穴穴區(qū)之間，微血管直徑百分比沒(méi)有顯著差異。KOA組與Control組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),KOA組與FM組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

3.2.4 各組微血管密度比較 實(shí)驗(yàn)第14天，PAI系統(tǒng)顯示各組的足三里、陽(yáng)陵泉、非穴穴區(qū)之間，微血管密度無(wú)顯著差異KOA組與Control組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，KOA組與FM組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

注：A：陽(yáng)陵泉；B：足三里；C：非穴

表1 各組穴區(qū)微血管彎曲度

表2 各組足三里穴區(qū)微血管直徑百分比

表3 各組微血管密度單位:μm/mm3)

4 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎( Knee Osteoarthritis，KOA) 是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞以及骨質(zhì)增生為特征的膝骨關(guān)節(jié)退行性病變[16]，隸屬于中醫(yī)的“痹癥”“筋痹”等范疇，是典型的外經(jīng)病。大量臨床實(shí)踐證明,針刺對(duì)于KOA具有較好的臨床療效且選穴方法成熟,[17-19]。根據(jù)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論，腧穴具有反映和調(diào)節(jié)機(jī)體功能狀態(tài)的雙重特性,所以特定疾病的治療常用穴也是疾病在體表的重要反映點(diǎn)，如處于敏化態(tài)的穴位[20]。KOA治療常用穴為陽(yáng)陵泉、足三里、鶴頂?shù)萚21-24],1項(xiàng)有關(guān)腧穴熱敏化規(guī)律的研究發(fā)現(xiàn)陽(yáng)陵泉、足三里等穴發(fā)生熱敏化的頻率較高[25],因此本實(shí)驗(yàn)將KOA作為研究平臺(tái)，以陽(yáng)陵泉、足三里為研究切入點(diǎn)，通過(guò)PAI系統(tǒng)來(lái)觀察此二穴與非穴局部微血管的結(jié)構(gòu)狀態(tài)差異，用以闡明病理狀態(tài)下腧穴局部微循環(huán)是否發(fā)生了形態(tài)改變。

本實(shí)驗(yàn)采用向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水作為假模型用以排除由MIA模型制備手術(shù)引發(fā)的非特異性膝骨關(guān)節(jié)損傷對(duì)有關(guān)結(jié)果的影響。番紅固綠染色結(jié)果顯示KOA組小鼠的左膝關(guān)節(jié)發(fā)生了明顯的組織形態(tài)學(xué)改變，膝關(guān)節(jié)軟骨破壞明顯，而假模型組注射生理鹽水后膝關(guān)節(jié)組織形態(tài)正常，由此證明造模成功。

本研究首次將PAI技術(shù)應(yīng)用到針刺研究中獲取了活體穴位10 μm空間分辨率的光聲成像圖。本實(shí)驗(yàn)PAI結(jié)果顯示,空白組、膝骨關(guān)節(jié)炎模型組和假模型組小鼠足三里、陽(yáng)陵泉及非穴的微血管彎曲度、直徑百分比及密度均未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)。此結(jié)果提示在穴位敏化狀態(tài)下，腧穴及非穴局部微循環(huán)結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)KOA模型大鼠在穴位敏化狀態(tài)下，陽(yáng)陵泉和足三里穴位局部的微循環(huán)灌注量明顯增加[26-28]。前期研究還發(fā)現(xiàn)急性心肌缺血組家兔的血清肌酸激酶同工酶水平及雙側(cè)內(nèi)關(guān)、神門、心俞穴血流灌注量與正常組及假手術(shù)組相比，在實(shí)驗(yàn)第0、7天均未見(jiàn)顯著性差異，而在實(shí)驗(yàn)第8天出現(xiàn)顯著性差異，由此證明腧穴敏化會(huì)伴隨局部血流灌注量增加且穴位敏化具有時(shí)間和空間的特異性[29]。本實(shí)驗(yàn)未觀察到穴位敏化時(shí)局部微循環(huán)結(jié)構(gòu)上的改變，分析可能是以下幾種原因?qū)е拢孩僭贙OA疾病狀態(tài)下，治療常用穴位陽(yáng)陵泉、足三里的局部微循環(huán)結(jié)構(gòu)變化不明顯，穴位敏化的重要內(nèi)涵可能是微循環(huán)的功能狀態(tài)改變，而非形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。有研究表明,腧穴局部神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜作用可能導(dǎo)致穴位敏化過(guò)程中微循環(huán)的功能變化，穴位敏化的具體內(nèi)涵是多方面、多層次的[30-31]。②本課題組前期研究結(jié)果表明穴位敏化具有時(shí)間和空間的特異性，因此可能由于本實(shí)驗(yàn)只在1個(gè)時(shí)間點(diǎn)(即造模后第14天)選取了兩個(gè)穴位進(jìn)行觀察，而此時(shí)間點(diǎn)可能不是足三里、陽(yáng)陵泉兩穴位呈現(xiàn)敏化狀態(tài)的最佳時(shí)間點(diǎn)，所以未能觀察到3組的微血管形態(tài)差異。由于本研究是穴位敏化微循環(huán)狀態(tài)改變內(nèi)涵研究的初步探索，雖未能觀察到KOA疾病狀態(tài)下穴位敏化時(shí)微血管發(fā)生形態(tài)改變，但為后期研究提供了思路與借鑒：一方面可以增加觀察的時(shí)間點(diǎn)，在造模過(guò)程中及成模后一段時(shí)間都進(jìn)行微血管形態(tài)的監(jiān)測(cè)，力圖呈現(xiàn)發(fā)病過(guò)程中穴位敏化發(fā)生的動(dòng)態(tài)過(guò)程，找到觀察敏化發(fā)生的最佳時(shí)間點(diǎn)，同時(shí)也可以增加觀察穴位，找到針對(duì)KOA疾病探究穴位敏化內(nèi)涵的最佳腧穴；另一方面將研究重心轉(zhuǎn)移到穴位敏化微循環(huán)的功能改變上，運(yùn)用PAI技術(shù)觀察微血管氧化血紅蛋白含量、血流量及氧飽和度等變化，以反映穴位處于敏化狀態(tài)時(shí)微循環(huán)的功能改變，實(shí)現(xiàn)穴位從生理“沉寂”狀態(tài)到病理“激活”狀態(tài)下組織功能層面的可視化成像。

本研究首次將PAI技術(shù)應(yīng)用到穴位敏化狀態(tài)下腧穴局部微血管形態(tài)改變的研究中，不僅僅是穴位活體成像研究中的重大突破,同時(shí)也為穴位敏化實(shí)時(shí)高分辨率成像研究打下了科學(xué)基礎(chǔ)。由于是對(duì)活體相同位點(diǎn)的重復(fù)性觀察，后期研究可采用可穿戴地實(shí)時(shí)監(jiān)控設(shè)備以便對(duì)微循環(huán)進(jìn)行更加精確、便利的觀察。雖然我們未能觀察到KOA相關(guān)腧穴局部微血管形態(tài)改變，但為進(jìn)一步研究穴位敏化的內(nèi)涵提供了重要思路。