茜草總蒽醌對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠白細(xì)胞降低的保護(hù)作用及其作用機(jī)制

張振巍，崔璀，張娜娜

(1.中國人民解放軍第一五五中心醫(yī)院，河南 開封 475003； 2.河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院，河南 開封 475000； 3.開封市中醫(yī)院，河南 開封 475000)

白細(xì)胞減少在臨床放、化療中較為常見，治療中多采用粒細(xì)胞集落刺激因子類藥物，但該類藥物價(jià)格昂貴，不良反應(yīng)較大，可引起骨痛、發(fā)熱、白細(xì)胞減少等不良反應(yīng)，有些藥物還可能刺激某些惡性腫瘤的生長。因此，尋找治療白細(xì)胞減少癥的低毒高效藥物成為近幾年研究的熱點(diǎn)。植物多糖類大分子成分能激活免疫受體，提高機(jī)體免疫能力，并且毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好,在臨床研究中得到深入發(fā)展。為拓展植物藥在臨床的應(yīng)用范圍，中藥組分對(duì)機(jī)體免疫的作用在近幾年研究中逐漸深入，但也有些非多糖類成分對(duì)白細(xì)胞減少癥有著積極的治療作用，如雞血藤[1]有效部位群(總黃酮類成分)在4.05 g/kg的給藥劑量以上對(duì)環(huán)磷酰胺(CTX)致白細(xì)胞低下的大鼠有較好的升白作用，與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明雞血藤黃酮類成分能有效拮抗免疫抑制大鼠的白細(xì)胞減少。六月青皂苷類成分可顯著提高CTX免疫抑制模型小鼠的特異性及非特異性免疫反應(yīng)，提高其免疫力[2]。前期研究中,課題組發(fā)現(xiàn)茜草總蒽醌(TAR)能明顯促進(jìn)機(jī)體免疫、延長免疫抑制小鼠生存時(shí)間，基于此，本研究從保護(hù)白細(xì)胞減少為基礎(chǔ)，探討茜草總蒽醌對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠白細(xì)胞降低的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠18～22 g，購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。雌雄各半。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(豫)2013-0002，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，溫度控制在19℃～25℃，相對(duì)濕度為30%～70%。

1.2 藥品與試劑

環(huán)磷酰胺注射液(CTX，江蘇恒瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)為H32020857)；大鼠抗小鼠CD34+抗體(美國CALTAG公司)；血清粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF，南京建成生物工程公司，批號(hào)為0504191)。地榆升白片(成都地奧集團(tuán)天麻藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為13080627,0.1 g/片)。茜草總蒽醌(Total Anthraquinone ofRubiaCordifoliaL.,TAR)的制備：取茜草飲片500 g，加入10倍量乙醇，連續(xù)回流提取3次，每次1.5 h，減壓回收乙醇，用石油醚萃取，除去醚溶性成分，再將醇濃縮液用氯仿-乙酸乙酯(1:2)萃取2次，合并萃取液，真空干燥即得茜草總蒽醌[3]。

1.3儀器

XSP-C204型生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)；AY120電子天平(SHI-MAZDU公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型制備

取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為正常組、模型組、地榆升白組(簡稱陽性組，臨用前研成細(xì)粉，用生理鹽水配制成濃度為0.1 g/15 mL的混懸液，實(shí)驗(yàn)給予100 mg/kg劑量)和茜草總蒽醌高、低劑量組(簡稱高、低劑量組，用量分別為120 mg/kg、60 mg/kg)，除正常組外其余各組小鼠均腹腔注射等劑量的環(huán)磷酰胺100 mg/kg，連續(xù)3天，每天1次，復(fù)制白細(xì)胞減少動(dòng)物模型[4-5]。

2.2 外周血WBC測(cè)定

小鼠末次給藥后30 min，眼眶靜脈叢取血，按照常規(guī)方法在低倍顯微鏡下計(jì)數(shù)。

2.3 BMC測(cè)定

小鼠脫臼處死，分離并取出右側(cè)股骨中斷7 mm，用3%乙酸溶液沖出骨髓細(xì)胞，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤上計(jì)數(shù)四個(gè)大方格的細(xì)胞數(shù)，然后乘以2.5×104，即得1根股骨中骨髓有核細(xì)胞總數(shù)[6-7]。

2.4 CD34+細(xì)胞檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[1]方法檢測(cè)：用含牛血清白蛋白濃度為0.2 %的磷酸鹽緩沖溶液沖出小鼠左側(cè)股骨骨髓細(xì)胞，取1×106個(gè)細(xì)胞加入30 μL正常小鼠血清以封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)，加入10 μL FITC標(biāo)記的CD34+抗體，對(duì)照管中加入相應(yīng)的對(duì)照抗體，4℃避光反應(yīng)30 min，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，反應(yīng)5 min后，沖洗2次，加入濃度為3 μg/mL的碘化丙啶染液，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)檢測(cè)

小鼠處死后，取出各組小鼠的脾臟和胸腺，分別稱重后計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)=臟器重量/體質(zhì)量

2.6 脾集落形成單位(CFU-S)檢測(cè)

參照相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，各組小鼠脫臼處死后，取出脾臟，去除筋膜，稱重后固定于Bauin染液中，24 h后鏡下觀察、計(jì)數(shù)。

2.7 血清G-CSF活性測(cè)定

將每組小鼠的血液常溫下靜置30 min后，離心15 min，3 500 r/min，取上清液，按照試劑盒說明測(cè)定G-CSF活性。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 茜草總蒽醌對(duì)CTX致小鼠WBC、BMC細(xì)胞及臟器指數(shù)的影響

由表1可以看出：模型組的WBC、BMC細(xì)胞及臟器指數(shù)等指標(biāo)均低于正常組(P<0.05)，說明CTX對(duì)小鼠免疫應(yīng)答出現(xiàn)抑制狀態(tài)，提示模型復(fù)制成功。陽性組和茜草總蒽醌的高、低劑量組對(duì)CTX致小鼠WBC、BMC細(xì)胞及臟器指數(shù)均有不同程度改善，與模型組比較均有顯著性差異(P<0.05)；其中高劑量組的TAR對(duì)WBC的恢復(fù)能力優(yōu)于BMC，升高免疫抑制小鼠WBC數(shù)量與正常組相當(dāng)，稍低于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比顯示沒有顯著性差異(P>0.05)；TAR高、低劑量組能顯著對(duì)抗CTX致小鼠免疫器官萎縮的癥狀，即提高免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)，且高劑量組明顯優(yōu)于低劑量組治療效果(P<0.05)，說明茜草總蒽醌對(duì)抗CTX致小鼠白細(xì)胞降低呈現(xiàn)劑量依賴作用；提示TAR對(duì)免疫器官有較好的保護(hù)作用，并能積極恢復(fù)CTX致小鼠的免疫抑制狀態(tài)。

表1 各組對(duì)CTX致小鼠WBC、BMC細(xì)胞及臟器指數(shù)影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05。

3.2 茜草總蒽醌對(duì)CTX致小鼠CD34+、CFU-S、血清G-CSF的影響

正常狀態(tài)下機(jī)體造血主要由骨髓承擔(dān)，脾臟只是肩負(fù)造血的儲(chǔ)備功能，因此脾臟指數(shù)、CFU-S指標(biāo)并不高，模型組的CFU-S指標(biāo)較正常組明顯下降(P<0.05)，說明小鼠造血組織大量破壞、萎縮，這與脾臟指數(shù)降低相一致。CD34+抗原陽性率反映出小鼠造血干/祖細(xì)胞數(shù)量的變化，由表2可以看出：陽性組和TAR高、低劑量組均能大幅度的提升CD34+抗原陽性率，高劑量的TAR對(duì)其提升水平甚至高于正常組，與正常組比較有顯著性差異(P<0.05)，提示TAR高劑量時(shí)能迅速恢復(fù)小鼠體內(nèi)造血干細(xì)胞的造血功能，使造血干/祖細(xì)胞數(shù)量增加；此調(diào)控作用與G-CSF響應(yīng)相一致，從多角度反應(yīng)了TAR對(duì)CTX致小鼠白細(xì)胞降低的保護(hù)作用可能與其能快速恢復(fù)造血干/祖細(xì)胞數(shù)量，增加CD34+、CFU-S、血清G-CSF指標(biāo)有關(guān)。

表2 各組對(duì)CTX致小鼠CD34+、CFU-S、血清G-CSF指標(biāo)影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05。

4 討論

CTX是一種細(xì)胞周期非特異性廣譜抗腫瘤藥物和免疫抑制劑，其殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也可對(duì)正常組織細(xì)胞造成傷害，如淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞等，從而造成免疫功能及造血功能低下。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠連續(xù)腹腔注射3天100 mg/kg，小鼠白細(xì)胞數(shù)、骨髓有核細(xì)胞數(shù)、免疫器官質(zhì)量均明顯低于正常組(P<0.05)，說明模型復(fù)制成功。地榆升白片是中成藥制劑，君藥是地榆，從其化學(xué)成分的角度來看，主要含有皂苷、鞣質(zhì)、黃酮類成分，具有止血、抗菌消炎、促進(jìn)傷口愈合等作用。研究表明該制劑能顯著改善骨髓微循環(huán)的造血環(huán)境，促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞增殖及分化，并能顯著改善免疫抑制小鼠的外周血白細(xì)胞數(shù)量[10]，因此實(shí)驗(yàn)中選擇該成藥作為陽性對(duì)照藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

CD34+是20世紀(jì)80年代中期由美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞表面分子，其在正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞中約占1%～4%，因此CD34+是造血干細(xì)胞特異性的表面標(biāo)記物，在臨床上，通常采用流式細(xì)胞儀對(duì)CD34+造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)以評(píng)估骨髓動(dòng)員效果[11]。CD34+抗原選擇性表達(dá)于小鼠早期造血干/祖細(xì)胞膜表面，并隨細(xì)胞分化成熟而減少至消失，是小鼠造血干/祖細(xì)胞的表面標(biāo)志，其數(shù)量的變化能反映出小鼠造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量；從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，模型組CD34+細(xì)胞與正常組比較陽性百分率大幅度下降(P<0.05)，說明模型復(fù)制成功；高、低劑量的茜草總蒽醌有不同程度的升高CD34+細(xì)胞的作用，高劑量的TAR組陽性率較正常組高，提示TAR能增加造血細(xì)胞的分化，促進(jìn)細(xì)胞因子分化、成熟[12]。G-CSF是正常造血細(xì)胞的增殖分化過程中一種重要的造血正性調(diào)控因子，能促進(jìn)骨髓粒系、單核細(xì)胞系、巨噬細(xì)胞系發(fā)育和成熟，增加外周血成熟粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞功能的一種細(xì)胞因子[13-14]；數(shù)據(jù)顯示，陽性組和TAR高、低劑量組均能不同程度的提升G-CSF水平，且TAR高劑量組與陽性組作用強(qiáng)度相當(dāng)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；提示TAR能促進(jìn)造血調(diào)控因子的分化，對(duì)造血細(xì)胞的功能恢復(fù)有積極促進(jìn)作用，提升免疫抑制小鼠的免疫能力，對(duì)抗CTX誘導(dǎo)的免疫抑制，這可能是TAR升高白細(xì)胞、促進(jìn)骨髓造血系統(tǒng)恢復(fù)的機(jī)制之一。

外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)是腫瘤化療過程中常規(guī)檢查指標(biāo)之一，反映了放療、化療對(duì)骨髓的抑制程度和機(jī)體免疫狀態(tài)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的WBC計(jì)數(shù)較正常組低，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明模型復(fù)制成功。陽性組和高、低劑量的TAR能明顯對(duì)抗CTX致小鼠白細(xì)胞的降低(P<0.05)，TAR的對(duì)抗作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。骨髓有核細(xì)胞(BMC)包含了粒系、紅系、巨核系的祖細(xì)胞，其計(jì)數(shù)在一定程度上反映了骨髓造血細(xì)胞的增生情況，實(shí)驗(yàn)表明，TAR能升高CTX致小鼠的BMC降低，說明TAR可能通過刺激骨髓造血功能增加血液白細(xì)胞數(shù)量[15]。脾臟、胸腺是機(jī)體重要的免疫器官，同時(shí)脾臟還有一定的造血功能，當(dāng)骨髓功能受損時(shí)，脾臟可代償性髓外造血。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAR高、低劑量組可明顯拮抗CTX導(dǎo)致的小鼠免疫器官質(zhì)量降低(P<0.05)，提示TAR能促進(jìn)骨髓造血，對(duì)模型小鼠的免疫器官能起到有一定的保護(hù)作用。CFU-S是脾臟造血干細(xì)胞在脾臟表明產(chǎn)生細(xì)小的顆粒狀突擊，即為脾結(jié)節(jié)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TAR高、低劑量組對(duì)造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量和增殖能力有保護(hù)作用，這與WBC和BMC檢測(cè)結(jié)果相一致。

綜上所述，茜草總蒽醌(TAR)可顯著對(duì)抗環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠白細(xì)胞降低作用，其作用機(jī)制可能與TAR誘導(dǎo)刺激骨髓造血功能恢復(fù)，引導(dǎo)造血調(diào)控因子分化，增加血液白細(xì)胞數(shù)量有關(guān)；同時(shí)TAR還能刺激機(jī)體的免疫器官，促進(jìn)脾臟造血干細(xì)胞脾結(jié)節(jié)的產(chǎn)生，進(jìn)而機(jī)體自身抵抗力，發(fā)揮對(duì)白細(xì)胞的保護(hù)作用。