高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練對(duì)大鼠骨骼肌細(xì)胞自噬的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制

李方暉，艾競(jìng)一，李 濤，孫 磊

（1．南京師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210046；2．華南師范大學(xué) 激光運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室和運(yùn)動(dòng)再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510006）

1 前言

乙醛脫氫酶 2（acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）（Zhang et al.,2017）和去乙?；?（sirtuin 3,SIRT3）(王海濤 等,2011)是線粒體生物發(fā)生和自噬的上游調(diào)控因子。SIRT3（Lin et al.,2014; Palacios et al.,2009）和 ALDH2（GUO et al.,2015）基因敲除小鼠的骨骼肌和心肌腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）活性降低，進(jìn)而促使骨骼肌和心肌自噬活性下降（Nakashima et al.,2014）；相反，促進(jìn)骨骼肌 SIRT3（Lin et al.,2014）和ALDH2（Zhang et al.,2017）蛋白表達(dá)可激活骨骼肌自噬，改善機(jī)體有氧耐力。綜上所述，SIRT3和ALDH2在維持骨骼肌線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)功能過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但HIIT是否能促進(jìn)骨骼肌SIRT3和 ALDH2蛋白表達(dá)鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本文擬探討 10周 HIIT對(duì)大鼠股直?。ㄒ钥旒±w維為主）和比目魚(yú)?。ㄒ月±w維為主）（Carmeli et al.,2005）兩種不同類型肌纖維的自噬相關(guān)蛋白和線粒體 SIRT3和ALDH2蛋白表達(dá)的影響，揭示 HIIT對(duì)骨骼肌自噬的影響及其潛在的作用機(jī)制。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠34只，約8周齡，體重 369.00±24.13 g，廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK【粵】2013-0002）。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物常規(guī)飼料及墊料由廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方案獲得廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心使用倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有大鼠保持自由飲食，飼料供給量根據(jù)體重增長(zhǎng)相應(yīng)的增加，每周更換墊料2～3次，環(huán)境溫度20℃～23℃，相對(duì)濕度50%～70%，采用自然光照。

2.2 動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)方案

大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為 3組，即安靜組（SC,n =10）、中等強(qiáng)度持續(xù)訓(xùn)練組（MICT,n =12）和高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練組（HIIT,n =12）。MICT組和HIIT組在正式訓(xùn)練前進(jìn)行 2周的適應(yīng)訓(xùn)練。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)【型號(hào)FD000043】購(gòu)置于廣州飛迪生物科技有限公司。正式訓(xùn)練方案參照 Criswell等（1993）微調(diào)。MICT組跑步速度為28 m/min，根據(jù)Bedford等（1979）和Liao等（2015）估算約為70% VO2max；HIIT組高強(qiáng)度跑步速度42 m/min約為95%～99% VO2max（洪平 等,2002; Sariret al.,2015），間歇期跑步速度18 m/min約為40%～45% VO2max（洪平等, 2002; Bedfordet al.,1979）。適應(yīng)訓(xùn)練后進(jìn)行正式訓(xùn)練（表 1），訓(xùn)練時(shí)段為晚間 18:30～22:00，周六和周日停訓(xùn)。

表1 本研究高強(qiáng)度間歇性訓(xùn)練與中等強(qiáng)度持續(xù)訓(xùn)練實(shí)施方案一覽表Table 1 Programs of HIIT and MICT Training

2.3 測(cè)定跑步力竭時(shí)間和力竭測(cè)試前后的血乳酸

在末次訓(xùn)練后的次日對(duì)各組大鼠跑步力竭時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，具體方法參考施曼莉等（2015）文獻(xiàn)方法執(zhí)行。并在力竭時(shí)間測(cè)試前（pre-EX）、力竭時(shí)間測(cè)試即刻（IEX）、力竭時(shí)間測(cè)試后10 min（10 min POST）和力竭時(shí)間測(cè)試后3 h（3 hPOST）尾靜脈取血測(cè)定血乳酸濃度（Neves et al.,2017）。

2.4 取材

為了去除力竭測(cè)試導(dǎo)致的急性效應(yīng)的干擾，所有大鼠在力竭時(shí)間測(cè)試后先靜息24 h，隨后進(jìn)行禁食12 h，禁食處理完畢后按照力竭時(shí)間測(cè)試的順序?qū)Υ笫舐樽硖幩溃ㄊ┞?等,2015）。步驟：按照4 ml/kg劑量10%水合氯醛麻醉后斷頸，隨后迅速取出股四頭肌、腓腸肌和比目魚(yú)肌稱重，分別計(jì)算與體重的比值作為骨骼肌質(zhì)量指數(shù)。將股直肌和比目魚(yú)肌（Carmeli et al.,2005）用錫紙包裹投入液氮后置于-80℃冰箱保存。

2.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

取股直肌和比目魚(yú)肌進(jìn)行蛋白提取和定量，并將各組蛋白樣品在4%濃縮膠80 V恒壓30 min，隨后在12%分離膠150 V恒壓60 min，300 mA恒定電流120 min；5%脫脂奶粉室溫封閉 60 min，一抗孵育過(guò)夜；后轉(zhuǎn)移于聚偏二氟乙烯膜上，再以1:1 000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（二抗）于37℃孵育60 min，洗滌后置于暗室曝光成像。利用Image J軟件讀取各條帶灰度值，結(jié)果以目標(biāo)蛋白灰度值與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）灰度值的比值表示。目標(biāo)蛋白一抗：微管相關(guān)蛋白輕鏈 3A/B（microtubuleassociated protein light chain 3A/B, LC3A/B）、自噬相關(guān)蛋白（autophagy related gene,ATG）-5/-3/-7/-12/-16L、Beclin-1、ALDH2、SIRT3、細(xì)胞色素C氧化酶亞基IV（cytochrome C oxidase subunitIV, COXIV）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase,SDH）。ALDH2一抗購(gòu)于艾博抗公司，其余一抗購(gòu)于細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司。上述操作詳見(jiàn) QIAO等（2011）文獻(xiàn)。

Research on the influence of the opening of residential district on the traffic state of the surrounding road network

2.6 透射電鏡觀察自噬體和線粒體的超微結(jié)構(gòu)

取比目魚(yú)肌組織在戊二醛固定后放入 1%鋨酸固定60 min，并采用丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑包埋，再置入烤箱中干燥；完成聚合后進(jìn)行超薄切片，以醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色后透射電鏡下觀察、拍照。每組 3只，每只 2個(gè)標(biāo)本，選取 6 000倍進(jìn)行拍攝，觀察比目魚(yú)肌自噬體和線粒體超微形態(tài)結(jié)構(gòu)。具體方法參考 He等（2012）文獻(xiàn)。

2.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，Graph Pad Prism軟件作圖。以平均數(shù)（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。對(duì)所有指標(biāo)均采用進(jìn)單因素方差分析，多重比較采用 Tukey比較法，顯著性水平為 P＜0.05，非常顯著性水平為 P＜0.01；采用Pearson相關(guān)分析計(jì)算各變量間的相關(guān)系數(shù)，用“r”表示。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體重和骨骼肌質(zhì)量指數(shù)的改變

圖 1顯示各組大鼠最終體重和骨骼肌質(zhì)量指數(shù)的變化情況。HIIT和MICT組大鼠最終體重降低，與SC組相比有非常顯著性差異（P＜0.01）（圖 1A）；MICT組腓腸肌質(zhì)量指數(shù)（圖 1C）和股四頭肌質(zhì)量指數(shù)（圖 1D）分別增加21.80%和 12.10%，HIIT組腓腸肌質(zhì)量指數(shù)（圖 1C）和股四頭肌質(zhì)量指數(shù)（圖 1D）分別增加 14.60%和 10.60%，與SC組相比均有顯著性差異（P＜0.05）；HIIT和 MICT組比目魚(yú)肌質(zhì)量指數(shù)與 SC組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05，圖1B）。

圖1 各組大鼠的最終體重（A）比目魚(yú)?。˙）腓腸?。–）和股四頭?。―）質(zhì)量指數(shù)的變化Figure 1. Changes of FinalBody Weight (A) Soleus (B) Gastrocnemius (C) and Quadriceps (D) Muscles MassIndex

3.2 各組大鼠跑步力竭時(shí)間和力竭測(cè)試前后血乳酸水平的改變

圖2A顯示各組大鼠跑步力竭時(shí)間的變化情況。HIIT和MICT組大鼠跑步力竭時(shí)間明顯增加（圖 2A），與SC組相比有非常顯著性差異（P＜0.01）；HIIT組大鼠跑步力竭時(shí)間長(zhǎng)于MICT組，與MICT組相比有顯著性差異（P＜0.05）。

圖2B顯示各組大鼠力竭測(cè)試前后的血乳酸變化。HIIT和MICT組力竭測(cè)試后即刻血乳酸均降低，與SC組相比均有非常顯著性差異（P＜0.01）；在力竭測(cè)試后 10 min，HIIT組大鼠血乳酸低于SC組，與SC組相比有顯著性差異（P＜0.05），但MICT組與SC組相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠跑步力竭時(shí)間（A）和跑步力竭時(shí)間測(cè)試前后的血乳酸（B）變化Figure 2. Changes of Time to Exhaustion(A) and Blood Lactate Levels (B) after theExhaustionTest

3.3 線粒體功能蛋白及其調(diào)控蛋白表達(dá)的改變

圖3A顯示各組大鼠比目魚(yú)肌COXIV、SDH、SIRT3和ALDH2蛋白表達(dá)情況。HIIT和MICT組比目魚(yú)肌COXIV、SDH、SIRT3蛋白表達(dá)增加，且分別與SC組相比有非常顯著性（P＜0.01）和顯著性（P＜0.05）差異；HIIT組比目魚(yú)肌COXIV蛋白表達(dá)高于MICT組，與MICT組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3 比目魚(yú)?。ˋ）、股直?。˙）線粒體功能蛋白表達(dá)和比目魚(yú)肌線粒體超微結(jié)構(gòu)（C）變化Figure 3. Changes of Mitochondrial Function Protein Expression inthe Soleus (A),Rectus Femoris Muscles(B), andUltrastructure ofSoleusMuscleMitochondria (C)

圖 3B顯示各組大鼠股直肌 COX IV、SDH、SIRT3和ALDH2蛋白表達(dá)情況。HIIT組和 MICT組股直肌 SDH蛋白表達(dá)高于SC組，與SC組相比有顯著性差異（P＜0.05）；HIIT組股直肌COX IV和SIRT3蛋白含量高于SC組，與SC組相比有非常顯著性差異（P＜0.01）；MICT組股直肌COX IV和SIRT3蛋白表達(dá)高于SC組，但低于HIIT組，且分別與 SC和 HIIT組相比均有顯著性差異（P＜0.05）；HIIT組股直肌 ALDH2蛋白表達(dá)高于 SC組和 MICT組，且分別與 SC組和 MICT組相比有非常顯著性差異（P＜0.01）。

圖 3C顯示各組大鼠比目魚(yú)肌的線粒體超微結(jié)構(gòu)改變情況。HIIT和 MICT組大鼠比目魚(yú)肌的線粒體體積和內(nèi)膜嵴密度明顯增大。

3.4 骨骼肌自噬相關(guān)蛋白表達(dá)和自噬體形態(tài)的改變

圖 4顯示各組大鼠比目魚(yú)肌和股直肌的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)和比目魚(yú)肌自噬體形態(tài)的變化情況。圖 4A顯示，HIIT組比目魚(yú)肌 LC3-II/LC3-I比值、LC3-II、Beclin-1、ATG-3、ATG-5、ATG-7和ATG-12蛋白表達(dá)高于SC組，且與 SC組相比均有顯著性差異（P＜0.05）；圖 4B顯示，與SC組相比，HIIT組股直肌Beclin-1、ATG-5和ATG-7蛋白表達(dá)高于SC組，與SC組相比有顯著性差異（P＜0.05）；透射電鏡顯示，HIIT組大鼠比目魚(yú)肌細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)典型的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體（圖4C）。

圖4 比目魚(yú)肌（A）和股直?。˙）自噬相關(guān)蛋白表達(dá)和自噬體形態(tài)（C）的改變Figure4. Changes of Autophagy Protein ExpressionintheSoleus(A) and RectusFemorisMuscles (B) andthe Form of Autophagic Vacuole (C)

3.5 相關(guān)性分析

圖5A顯示，大鼠跑步力竭時(shí)間與股直肌SDH（r=0.58,P＜0.05）、COXIV（r=0.74,P＜0.01）、Beclin-1（r=0.63,P＜0.05）、ALDH2（r=0.68,P＜0.01）和 SIRT3（r=0.63,P＜0.05）蛋白含量呈正相關(guān)；跑步力竭時(shí)間與比目魚(yú)肌SDH（r=0.87,P＜0.01）、COXIV（r=0.70,P＜0.01）、Beclin-1（r=0.78,P＜0.01）和 LC3-II（r=0.63,P＜0.05）蛋白含量呈正相關(guān)。

圖5B顯示，股直肌SIRT3蛋白含量與SDH（r=0.74,P＜0.01）、COXIV（r=0.87,P＜0.01）、Beclin-1（r=0.66,P＜0.05）和 ALDH2（r=0.63,P＜0.05）蛋白含量呈正相關(guān)；股直肌 ALDH2蛋白含量與 Beclin-1（r=0.94,P＜0.01）及COXIV（r=0.66,P＜0.05）蛋白含量呈正相關(guān)。

圖 5C顯示，比目魚(yú)肌 SIRT3蛋白含量與 SDH（r=0.58,P＜0.05）、COXIV（r=0.72,P＜0.01）蛋白含量及LC3-II/LC3-I 比值（r=0.61,P＜0.05）呈正相關(guān)，SDH蛋白含量與LC3-II/LC3-I比值（r=0.58,P＜0.05）呈正相關(guān)。

圖5 各功能參數(shù)之間的Pearson相關(guān)性分析Figure 5. Pearson Correlation Analysis among Functional Variables

4 討論

4.1 HIIT對(duì)大鼠有氧代謝能力的影響

HIIT是提高有氧耐力省時(shí)有效的訓(xùn)練模式（胡國(guó)鵬等,2017; Gibala et al.,2009; Little et al.,2010; Pereira et al.,2013;Perry et al.,2008）。與MICT相比，HIIT能更顯著提高骨骼肌的線粒體氧化酶活性和脂肪氧化速率（梁春瑜 等,2017;施曼莉 等,2015;王林佳 等,2016;Helgerud et al.,2007; Little et al.,2010; Lkahtani et al.,2013; Weng et al.,2013）。本文也證實(shí)，HIIT對(duì)提高大鼠跑步力竭時(shí)間優(yōu)于 MICT組（圖2A）；在對(duì)跑步力竭時(shí)間測(cè)試前后血乳酸測(cè)定也顯示，HIIT組大鼠機(jī)體的血乳酸清除能力也明顯增強(qiáng)（圖2B）；此外，本文也檢測(cè)了表征線粒體氧化磷酸化活性的COX IV和 SDH蛋白表達(dá)（田野,2003）。結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，HIIT和MICT均能上調(diào)比目魚(yú)肌和股直肌COX IV和SDH蛋白表達(dá)；但 HIIT組比目魚(yú)肌和股直肌 COX IV蛋白表達(dá)高于MICT組（圖3A和B）；采用TEM觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)也發(fā)現(xiàn)了HIIT組大鼠比目魚(yú)肌的線粒體體積和內(nèi)膜嵴密度增大的現(xiàn)象（圖 3C），這與已有文獻(xiàn)報(bào)道一致（Criswell et al.,1993; Macinnis et al.,2017）。本文相關(guān)性分析也顯示，比目魚(yú)肌和股直肌COX IV和SDH蛋白含量均與跑步力竭時(shí)間呈正相關(guān)（圖 5A）。已有文獻(xiàn)也表明，骨骼肌線粒體正向重塑與自噬活性的改變有關(guān)（梁春瑜 等,2017; Lira et al.,2013; Little et al.,2010; Sin et al.,2016; Webster et al.,2013）。本文發(fā)現(xiàn)的 HIIT組大鼠骨骼肌線粒體功能增強(qiáng)是否與細(xì)胞自噬活性上調(diào)有關(guān)？

4.2 HIIT對(duì)骨骼肌細(xì)胞自噬的影響

細(xì)胞自噬是在自噬相關(guān)蛋白調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)過(guò)程。自噬的啟動(dòng)源于 LC3蛋白翻譯，隨后被胞漿中的 ATG-4酶切轉(zhuǎn)變?yōu)?LC3-I形式；LC3-I在ATG-7、ATG-3及ATG-5—ATG-12—ATG-16復(fù)合物的作用下與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,PE）結(jié)合，形成具有膜結(jié)合能力的 LC3-II（漆正堂 等,2013; Laker et al.,2017）。因自噬泡閉合過(guò)程中僅LC3-II定位于吞噬泡膜上，故可將 LC3-II蛋白表達(dá)水平和 LC3-II/LC3-I比值分別用于表征自噬體形成和自噬活性水平（Ogura et al.,2011）。在自噬體的形成過(guò)程中，哺乳動(dòng)物第III類 PI3激酶（PI3K-III）與 Beclin-1及 ATG-14L形成Beclin-1復(fù)合物（Beclin-1 complex），加速自噬信號(hào)的傳遞，從而正向調(diào)控自噬體形成（Laker et al.,2017）。

本研究中，HIIT組大鼠比目魚(yú)肌LC3-II/LC3-I比值、LC3-II、Beclin-1、ATG-3、ATG-5、ATG-7 和 ATG-12 蛋白表達(dá)均明顯升高（圖 4A）。提示：HIIT可能加速了自噬體的延伸和閉合過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)自噬體的形成過(guò)程（圖6）。本文圖 4C透射電鏡也觀察到了比目魚(yú)肌典型雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。已有研究表明（祖靚 等,2013; He et al.,2012;Ogura et al.,2011），耐力運(yùn)動(dòng)和急性運(yùn)動(dòng)均能上調(diào)骨骼肌、心肌、肝臟、脂肪和大腦皮質(zhì)等組織的自噬活性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)運(yùn)動(dòng)刺激的代謝性適應(yīng)；然而，特異性敲除骨骼肌ATG-3基因的小鼠在急性運(yùn)動(dòng)過(guò)程更易引發(fā)氧化損傷，導(dǎo)致骨骼肌線粒體氧化功能失調(diào)和耐力下降（Lira et al.,2013）。細(xì)胞研究進(jìn)一步證實(shí)，增強(qiáng)自噬活性可促進(jìn)線粒體生物發(fā)生信號(hào)通路的激活（Sin et al.,2016; Webster et al.,2013）。本文相關(guān)性結(jié)果顯示：比目魚(yú)肌 LC3-II/LC3-I比值與SDH蛋白含量呈正相關(guān)（圖5C）；說(shuō)明，HIIT改善比目魚(yú)肌線粒體功能可能與自噬活性上調(diào)有關(guān)。

本文也發(fā)現(xiàn)，MICT與SC組相比，股直肌和比目魚(yú)肌的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化。這與 Lira等（2013）文獻(xiàn)報(bào)道一致。Lira等（2013）在檢測(cè) C57BL/6小鼠持續(xù)耐力運(yùn)動(dòng) 28天后比目魚(yú)肌 LC3-II/LC3-I比值也未發(fā)生改變。Schwalm等（2015）研究進(jìn)一步表明，耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌自噬活性的影響依賴于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。推測(cè)，本文中MICT組大鼠采用的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可能不足以促進(jìn)骨骼肌的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。然而，HIIT組股直肌 LC3-II/LC3-I比值及LC3-II、ATG-3、ATG-12蛋白表達(dá)并未明顯增加（圖4B），說(shuō)明 HIIT對(duì)骨骼肌自噬活性和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響也可能與肌纖維類型有關(guān)。

4.3 HIIT對(duì)骨骼肌自噬的機(jī)制探討

作為細(xì)胞內(nèi)的能量感應(yīng)器，AMPK被認(rèn)為是自噬的調(diào)控因子（漆正堂 等,2013）。AMPK通過(guò)抑制雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性及增加ATG-1激酶同源蛋白 ULK1磷酸化水平來(lái)啟動(dòng)自噬過(guò)程（漆正堂 等,2013）。作為 AMPK途徑的上游調(diào)節(jié)因子，SIRT3既能通過(guò)調(diào)控 AMPK活性間接上調(diào)自噬活性，也能對(duì)自噬相關(guān)蛋白乙?；揎椫苯哟龠M(jìn)自噬體的形成（Palacios et al.,2009; Shi et al.,2015）。此外，定位于線粒體基質(zhì)的ALDH2也能通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR通路實(shí)現(xiàn)對(duì)骨骼肌自噬的正向調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而保護(hù)急性運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌氧化損傷（Zhang et al.,2017）。而 SIRT3（Palacios et al.,2009）和 ALDH2（Nakashima et al.,2014）基因敲除小鼠的骨骼肌 AMPK/mTOR途徑及自噬活性明顯下調(diào)。總之，在調(diào)控自噬過(guò)程中，線粒體 SIRT3（Palacios et al.,2009; Shi et al.,2015）和 ALDH2（Guo et al.,2015）是AMPK/mTOR途徑的上游調(diào)控因子。盡管文獻(xiàn)報(bào)道了HIIT可激活骨骼肌AMPK（梁春瑜 等,2017; Gibalaet al.,2009），但SIRT3和ALDH2在HIIT激活骨骼肌自噬過(guò)程中的作用尚不清楚？

在本研究中，HIIT和 MICT均能促進(jìn)大鼠股直肌和比目魚(yú)肌SIRT3蛋白表達(dá)（圖3A和B）。這與前人研究一致（Hokari et al.,2010；Palacios et al.,2009）。矛盾的是，Edgett等（2016）和 Casuso等（2017）研究卻發(fā)現(xiàn)，6周沖刺訓(xùn)練無(wú)法上調(diào)受試者股外側(cè)肌 SIRT3蛋白表達(dá)；提示，運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌 SIRT3蛋白表達(dá)的影響可能與運(yùn)動(dòng)方式和骨骼肌類型有關(guān)。文獻(xiàn)表明（Lin et al.,2014），小鼠骨骼肌特異性過(guò)表達(dá) SIRT3可提升小鼠耐力水平；而這與骨骼肌 SDH和 COX IV活性增加有關(guān)（Finley et al.,2011;Vassilopoulos et al.,2014）。本文也證實(shí)，比目魚(yú)肌和股直肌SIRT3與SDH和COX-IV蛋白含量均呈正相關(guān)（圖5B和C）；同時(shí)，比目魚(yú)肌SIRT3蛋白含量也與LC3-II/LC3-I比值呈正相關(guān)（圖5 C）；推測(cè)，比目魚(yú)肌SIRT3可能通過(guò)正向調(diào)控自噬活性來(lái)提升線粒體功能。

與SC組大鼠相比，MICT組股直肌和比目魚(yú)肌ALDH2蛋白含量均無(wú)顯著性差異，盡管 HIIT組大鼠股直肌ALDH2蛋白表達(dá)增加并具有顯著性差異，但在比目魚(yú)肌中無(wú)顯著性差異（圖 3A、B）。值得注意的是，股直肌ALDH2蛋白含量與跑步力竭時(shí)間呈正相關(guān)（圖 5B），提示：股直肌 ALDH2蛋白表達(dá)上調(diào)可能與大鼠耐力水平提升有關(guān)。Zhang等（2017）研究證實(shí)，骨骼肌過(guò)表達(dá)ALDH2小鼠的跑步力竭時(shí)間明顯增加。該課題組另一項(xiàng)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ALDH2能通過(guò)上調(diào)SIRT3蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)線粒體氧化磷酸化蛋白表達(dá)（Hu et al.,2016）。本文也證實(shí)，股直肌ALDH2與SIRT3及COX IV蛋白含量均呈正相關(guān)（圖 5B）。綜上可知，盡管 ALDH2并未參與 HIIT對(duì)比目魚(yú)肌自噬的調(diào)控，但可能介導(dǎo)了HIIT對(duì)股直肌線粒體功能改善的過(guò)程。然而，HIIT是如何通過(guò) ALDH2調(diào)控線粒體氧化功能仍有待深入研究。

圖6總結(jié)了HIIT上調(diào)比目魚(yú)肌自噬活性的可能機(jī)制。盡管文獻(xiàn)報(bào)道了 HIIT上調(diào)骨骼肌 AMPK磷酸化活性（梁春瑜 等,2017; Gibala et al.,2009）；但遺憾的是，本文并未論證10周HIIT能上調(diào)比目魚(yú)肌AMPK磷酸化水平及其下游mTOR活性。因此，今后的研究應(yīng)在證實(shí)HIIT激活比目魚(yú)肌 AMPK/mTOR信號(hào)通路的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究 HIIT對(duì)SIRT3基因敲除小鼠比目魚(yú)肌自噬的影響，進(jìn)而明確SIRT3調(diào)控AMPK/mTOR通路介導(dǎo)了HIIT激活骨骼肌自噬的過(guò)程。

圖6 HIIT調(diào)控骨骼肌細(xì)胞自噬潛在機(jī)制示意圖Figure 6. Schematic of HIITRegulatedAutophagyand Relevant Mechanisms

5 小結(jié)

10周 HIIT能上調(diào)比目魚(yú)肌細(xì)胞自噬活性及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，但并未上調(diào)股直肌自噬活性，線粒體 SIRT3可能參與了HIIT對(duì)比目魚(yú)肌細(xì)胞自噬的調(diào)控過(guò)程。

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