PARP1調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的生長和遷移

游莉芳，魏 莉，吳家雪

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438; 2.解放軍401醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266071)

肝細(xì)胞癌(HCC)是死亡率最高的惡性腫瘤之一.在我國每年有大約38萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例數(shù)的51%[1].同時(shí)肝癌具有早期診斷難、惡性程度高、易復(fù)發(fā)以及總體生存期較短的特點(diǎn)[2].因此，闡明肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制十分迫切.

PARP1(poly (ADP-ribose) polymerase-1)是一種聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，其N端是含有3個(gè)鋅指基序的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；中間是BRCT(BRCA1 C-terminal motif)結(jié)構(gòu)域，能夠催化PARP1自身修飾；C端為高度保守的催化結(jié)構(gòu)域，主要進(jìn)行PAR(poly ADP-ribose)催化作用.PARP1主要在DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮作用.它能夠以NAD+為底物催化自身以及靶蛋白帶上多聚ADP核糖基鏈，從而促進(jìn)DNA損傷修復(fù)進(jìn)程[3-4].

有報(bào)道表明PARP1在多種癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[5].PARP1缺陷的小鼠易患乳腺癌、肺癌和肝癌風(fēng)險(xiǎn)增加[6].表明PARP1可能在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中重要作用.為了探究PARP1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，我們首先采用了免疫組化檢測了PARP1在肝癌以及癌旁組織中的表達(dá)水平.通過CRISPR/CAS9技術(shù)構(gòu)建了PARP1缺陷的肝癌細(xì)胞株并探究了PARP1缺陷對肝癌細(xì)胞的生長以及細(xì)胞遷移等方面的影響.本研究揭示了PARP1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的功能，表明PARP1可能是治療HCC的理想分子靶標(biāo).

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

人肝癌細(xì)胞株QGY-7703以及SMMC-7721均購自上海中科院細(xì)胞庫.DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清購自Thermo.雙抗(鏈霉素-青霉素)購自上海翊圣生物科技公司.轉(zhuǎn)染試劑PEI購自Polyscience.嘌呤霉素購自生工生物工程有限公司.CCK8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所.兔抗人PARP1多克隆抗體購自Abcam公司，兔抗人PARP2多克隆抗體購自Sigma公司，鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自Abmart公司.

1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

以10cm dish細(xì)胞用PEI轉(zhuǎn)染為例，在轉(zhuǎn)染前一天進(jìn)行鋪板，細(xì)胞匯合至80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染.準(zhǔn)備好兩個(gè)離心管，分別編號A、B.將250μL血清培養(yǎng)基加入A、B管中，隨后在A管中加入15μL PEI，嚴(yán)格孵育5min.在B管中加入5μg質(zhì)粒.孵育完畢，將A、B管混合震蕩混勻之后共同孵育20min.然后移入培養(yǎng)皿中，搖勻.6～8h之后換液.

1.3 PARP1缺陷株的構(gòu)建

首先在http:∥crispr.mit.edu設(shè)計(jì)的sgRNA引物中選取最適引物.PARP1缺陷的sgRNA序列為： GAGTACGCCAAGAGCGGGCG.將引物送公司合成正反向鏈.將濃度為10μmol/L的正反向引物等比混合置于98℃沸水中使其互補(bǔ)合成引導(dǎo)片段.隨后用BBSI限制性內(nèi)切酶將cas9載體以及引導(dǎo)片段進(jìn)行酶切.然后通過連接、轉(zhuǎn)化、菌落PCR以及測序鑒定得到陽性克隆.之后將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至QGY-7703以及SMMC-7721細(xì)胞中，36～48h之后消化收集細(xì)胞懸液按1∶10，1∶30，1∶60，1∶100進(jìn)行分盤.待細(xì)胞貼壁之后加入嘌呤霉素篩選3d，之后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至長出肉眼可見單克隆.然后挑取單克隆至24孔板中，待單克隆長滿時(shí)，收取單克隆進(jìn)行鑒定(此時(shí)需要留取部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)).首先進(jìn)行Western blot初篩，然后通過抽取細(xì)胞的全基因組DNA，以全基因組DNA為模板將靶點(diǎn)附近600bp左右序列通過PCR擴(kuò)增然后進(jìn)行測序，比對測序結(jié)果確定陽性克隆.之后對陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，然后凍存.

1.4 CCK8法檢測細(xì)胞增殖

首先制備細(xì)胞懸液，利用Bio-Rad TC-20通過細(xì)胞計(jì)數(shù)將懸液最終密度控制在每毫升1×104個(gè)細(xì)胞.然后以每孔接種100μL細(xì)胞懸液至96孔板中，每個(gè)樣本至少做3個(gè)復(fù)孔.細(xì)胞接種完畢之后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).一般細(xì)胞貼壁之后即可進(jìn)行第一次檢測(檢測持續(xù)7d，每次檢測間隔時(shí)間嚴(yán)格控制在24h)，CCK8用無血清培養(yǎng)基配置成含10% CCK8的混合液，以換液的形式加入.將96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～4h，之后用Bio-Tek SynergyTM2酶標(biāo)儀測定450nm吸光度，參比波長為630nm.

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

首先制備細(xì)胞懸液，然后將1×103個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中.接種完畢之后于37℃培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)12～15d，期間每隔3d換液一次.待克隆長至肉眼可見時(shí)，將6孔板取出.然后將培養(yǎng)基吸出，用1×PBS洗一次.用3%的多聚甲醛固定30min,固定完畢之后，將固定液吸出，用1×PBS洗一次.結(jié)晶紫染色1h，染色完畢將染色液吸出，然后用清水洗凈、晾干、拍照然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

1.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

首先將200μL無血清細(xì)胞懸液(QGY-7703細(xì)胞株3×104個(gè)細(xì)胞，SMMC-7721細(xì)胞株5×104個(gè)細(xì)胞)鋪于Transwell小室的上室中，下室加入600μL有血清培養(yǎng)基作為趨化因子，37℃培養(yǎng)28～36h.培養(yǎng)完畢將Transwell板拿出，進(jìn)行固定、染色、清洗、晾干之后利用Olympus IX73倒置顯微鏡進(jìn)行拍照.最后利用ImageJ軟件對遷移細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì).

1.7 免疫組化分析

肝癌組織芯片結(jié)果來自上海芯超生物科技有限公司.染色結(jié)果按照低(0～0.5)、中(0.5～1)、高(>1)分類統(tǒng)計(jì).利用卡方檢驗(yàn)對PARP1在肝癌與癌旁組織的染色結(jié)果的顯著性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用ImageJ軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用Excel軟件對樣本進(jìn)行雙尾T檢驗(yàn)分析，誤差線為各個(gè)復(fù)孔的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，柱形圖表示means±SD，3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化檢測PARP1在肝癌組織中的表達(dá)水平

圖1 PARP1在肝癌及癌旁組織中的免疫組化結(jié)果Fig.1 Immunohistochemical results of PARP1 in liver cancer and adjacent tissues

為了確定PARP1在HCC中的表達(dá)水平，我們在84對肝癌組織芯片中使用PARP1特異性抗體進(jìn)行了免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測PARP1在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)水平和分布情況.結(jié)果顯示，PARP1主要在肝癌及癌旁組織的細(xì)胞核中表達(dá)，癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(圖1).同時(shí)我們根據(jù)免疫組化的染色結(jié)果以及表達(dá)強(qiáng)度對PARP1在肝癌與癌旁組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析.如表1所示，PARP1在癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001).

2.2 PARP1缺陷的肝癌細(xì)胞株的構(gòu)建

既然PARP1在HCC中高表達(dá)，那么這提示我們PARP1可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用.因此我們通過CRISPR/CAS9技術(shù)構(gòu)建了PARP1缺陷的肝癌細(xì)胞株.我們根據(jù)http:∥crispr.mit.edu在PARP1的第1個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)了一條sgRNA： GAGTA-CGCCAAGAGCGGGCG.然后將sgRNA片段構(gòu)建至Px330-CRISPR/cas9載體.經(jīng)過嘌呤霉素處理之后得到單克隆細(xì)胞，再通過單克隆挑取、DNA抽提、Western blot篩選以及測序驗(yàn)證等步驟分別在QGY-7703以及SMMC-7721細(xì)胞株中得到了陽性克隆(圖2).

表1 PARP1在肝癌組織中的免疫組化結(jié)果分析

圖2 PARP1缺陷細(xì)胞株的Western blot檢測Fig.2 Western blot detection of PARP1 defective cell line(a)PARP1在QGY-7703中的敲除水平；(b)PARP1在SMMC-7721中的敲除水平,GAPDH作為內(nèi)參.

2.3 PARP1的缺陷抑制肝癌細(xì)胞的增殖

通過CCK8法檢測PARP1缺陷對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響.結(jié)果顯示，無論是在QGY-7703或是SMMC-7721細(xì)胞株中，PARP1缺陷都抑制肝癌細(xì)胞的增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3).此外，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在QGY-7703以及SMMC-7721細(xì)胞中PARP1缺陷抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4).

圖3 PARP1缺陷對肝癌細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of PARP1 deficiency on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells橫坐標(biāo)表示檢測天數(shù)，縱坐標(biāo)為450nm吸光度.(a) QGY-7703野生型以及缺陷株細(xì)胞(KO-1，KO-2)增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；(b) SMMC-7721野生型以及缺陷株細(xì)胞(KO-1，KO-2)增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖.*P<0.05,* *P<0.01,* * *P<0.001.

2.4 PARP1的缺陷不影響肝癌細(xì)胞的周期

既然PARP1能夠影響肝癌細(xì)胞的生長，我們猜想它是否是通過影響肝癌細(xì)胞周期來調(diào)控其生長過程.因此，我們接下來利用流式細(xì)胞術(shù)對缺陷型以及相應(yīng)野生型細(xì)胞株進(jìn)行了細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn).我們首先將SMMC-7721野生型以及缺陷型細(xì)胞株均勻接種于6孔板中，48h之后進(jìn)行上機(jī).結(jié)果表明野生型細(xì)胞株與缺陷型細(xì)胞株之間在細(xì)胞周期的分布上沒有顯著差異(圖5).

2.5 PARP1的缺陷不影響肝癌細(xì)胞的凋亡

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PARP1不影響肝癌細(xì)胞的周期，我們猜想PARP1的缺陷可能會影響肝癌細(xì)胞的凋亡.我們利用流式細(xì)胞術(shù)對PARP1缺陷型以及相應(yīng)野生型細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn).首先將SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板中，48h之后將細(xì)胞離心收集.利用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞術(shù)對野生型細(xì)胞以及缺陷型細(xì)胞進(jìn)行凋亡分析.結(jié)果表明野生型細(xì)胞株與缺陷型細(xì)胞株之間在細(xì)胞凋亡上沒有顯著差異(圖6).我們發(fā)現(xiàn)PARP1和PARP2在肝癌細(xì)胞凋亡中具有冗余功能，單獨(dú)缺陷PARP1或PARP2都不影響肝癌細(xì)胞的凋亡，但PARP1和PARP2都缺陷情況下，肝癌細(xì)胞的凋亡顯著增加(未發(fā)表).而在DNA損傷情況下(DNA-damaging agents誘導(dǎo))，PARP1缺陷會增加肝癌細(xì)胞的凋亡，但PARP1和PARP2雙缺陷肝癌細(xì)胞對DNA損失藥物更加敏感(未發(fā)表).

圖4 PARP1缺陷對肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig.4 Effect of PARP1 deficiency on the ability of hepatoma cell clone formation(a) QGY-7703野生型以及缺陷株(KO-1，KO-2)克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖以及統(tǒng)計(jì)圖；(b) SMMC-7721野生型以及缺陷株(KO-1，KO-2)克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖以及統(tǒng)計(jì)圖.*P<0.05,* *P<0.01,* * *P<0.001.

圖5 PARP1的缺陷不影響肝癌細(xì)胞的周期分布Fig.5 Defects of PARP1 do not affect the cell cycle of hepatoma cells(a) SMMC-7721野生型與缺陷型細(xì)胞(KO-1，KO-2)周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；(b) SMMC-7721野生型與缺陷型細(xì)胞(KO-1，KO-2)周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖.

圖6 PARP1的缺陷不影響肝癌細(xì)胞的凋亡Fig.6 Defects of PARP1 do not affect the apoptosis of hepatoma cells(a) SMMC-7721野生型與缺陷型細(xì)胞(KO-1，KO-2)凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；(b) SMMC-7721野生型與缺陷型細(xì)胞(KO-1，KO-2)凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖.

2.6 PARP1缺陷抑制肝癌細(xì)胞的遷移

之前有報(bào)道表明PARP1能夠調(diào)控與EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)并且PARP1缺陷能夠影響肺癌以及前列腺癌的轉(zhuǎn)移過程[7-9].因此，我們進(jìn)一步探究了PARP1缺陷對肝癌細(xì)胞遷移過程的影響.我們對PARP1的缺陷型以及野生型細(xì)胞進(jìn)行了Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明無論是在QGY-7703還是SMMC-7721細(xì)胞中PARP1缺陷都能抑制肝癌細(xì)胞的遷移，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7).

圖7 PARP1缺陷抑制肝癌細(xì)胞的遷移Fig.7 PARP1 deficiency inhibits migration of hepatoma cells(a) QGY-7703野生型與缺陷型細(xì)胞(KO-1，KO-2)的遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖與統(tǒng)計(jì)圖；(b) SMMC-7721野生型與缺陷型細(xì)胞(KO-1，KO-2)的遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖與統(tǒng)計(jì)圖.*P<0.05,* *P<0.01,* * *P<0.001.

3 討 論

PARP1是PARPs家族中最早被鑒定、研究最為廣泛的成員.研究表明PARP1在維持基因組穩(wěn)定性中具有重要作用.PARP1參與堿基切除修復(fù)，單鏈DNA斷裂修復(fù)，雙鏈DNA斷裂修復(fù)以及染色質(zhì)重塑等過程[10].此外，PARP1在多種生理、病理過程中都發(fā)揮重要功能.在轉(zhuǎn)錄調(diào)控，配子發(fā)生，細(xì)胞代謝，表觀遺傳以及細(xì)胞分化等方面均有相關(guān)報(bào)道[11].目前PARP抑制劑已應(yīng)用于多種臨床腫瘤的治療，臨床試驗(yàn)證明該類藥物毒副作用小，效果明確，短期耐受性良好，對于癌癥的治療前景十分廣闊.其中olaparib，niraparib等獲得了美國FDA的批準(zhǔn)上市，用于攜帶BRCA種系基因突變的晚期卵巢癌患者、復(fù)發(fā)性上皮卵巢癌、輸卵管癌或原發(fā)性腹膜癌女性患者的維持治療[12]，但是PARP抑制劑在HCC中的應(yīng)用尚未見報(bào)道.本研究通過免疫組化分析表明PARP1在肝癌組織中高表達(dá)，然后通過CRISPR/cas9技術(shù)構(gòu)建了PARP1缺陷的肝癌細(xì)胞株，我們對PARP1在肝癌中的功能進(jìn)行了進(jìn)一步的探究.結(jié)果表明，PARP1缺陷能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖和克隆形成并且PARP1缺陷抑制肝癌細(xì)胞的遷移.但是PARP1的缺陷不影響肝癌細(xì)胞的周期分布以及細(xì)胞凋亡.

綜上所述，本研究提示PARP1在肝癌細(xì)胞的生長以及遷移過程中發(fā)揮重要作用，為PARP抑制劑在HCC中的應(yīng)用提供了參考依據(jù).但是我們還未進(jìn)行深入探究.因此，我們接下來仍需進(jìn)一步探討PARP1在HCC中作用的分子機(jī)制，從而進(jìn)一步確定PARP1在HCC發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的角色.