抗腫瘤抗生素棘霉素的研究進(jìn)展

單傳坤，李良

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)

1 前言

非核糖體肽(nonribosomal peptides, NRP)是一類通過非核糖體途徑合成的代謝產(chǎn)物。棘霉素(echinomycin)是醌霉素(quinomycin)家族中一員，屬于NRP，是鏈霉菌產(chǎn)生的環(huán)肽類次生代謝產(chǎn)物。NRP的合成由多種多功能蛋白復(fù)合體完成，其中包括非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)復(fù)合體。研究表明，NRPS完成棘霉素大部分的生物合成，同時(shí)在生物合成基因簇編輯的具有多種功能的酶的催化下，最終形成具有雙生色團(tuán)的環(huán)肽類化合物。棘霉素的環(huán)肽骨架由多種不同的氨基酸構(gòu)成，這種環(huán)肽骨架是由NRPS催化兩條相同的多肽鏈?zhǔn)孜蚕噙B而成[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，棘霉素的藥理活性不僅是DNA的嵌入劑，還是乏氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的小分子抑制劑，能夠發(fā)揮抗腫瘤作用。近年來，棘霉素作為一種具有生物學(xué)活性的天然產(chǎn)物，其生物合成和抗腫瘤作用機(jī)制一直被廣泛研究，本文將從棘霉素的生物合成、抗腫瘤作用機(jī)制和應(yīng)用三方面進(jìn)行綜述。

1 棘霉素的生物合成

1.1 棘霉素的結(jié)構(gòu)特征

從棘霉素分子結(jié)構(gòu)(圖1)可以看出，其不僅具有環(huán)肽骨架，骨架間半胱氨酸殘基形成硫縮醛結(jié)構(gòu)，還具有兩個(gè)特征性喹喔啉生色團(tuán)結(jié)構(gòu)，該基團(tuán)是棘霉素抗腫瘤作用的活性基團(tuán)。

1.2 棘霉素的生物合成

棘霉素生物合成基因簇(Ecm)已經(jīng)被研究者發(fā)現(xiàn)，研究人員提出其合成途徑假說，并且部分合成途徑假說被證實(shí)，但其具體的生物合成機(jī)制一直在研究中[2-5]。根據(jù)棘霉素結(jié)構(gòu)特征，其生物合成包括生色團(tuán)的生物合成和環(huán)肽骨架的生物合成。首先是生色團(tuán)的生物合成。L-色氨酸被廣泛證實(shí)為生色團(tuán)生物合成的起始化合物[5-6]。Watanabe等[2,6-8]首次運(yùn)用大腸埃希菌作為模式生物體，構(gòu)建棘霉素生物合成基因并將其導(dǎo)入大腸埃希菌，組裝具有生物活性的非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)復(fù)合體，驗(yàn)證了喹喔啉—甲?；?QXC)生色團(tuán)合成途徑假說部分內(nèi)容(圖2)，由1(L-tryptophan，L-色氨酸)到2(quinoxaline-2-carboxylic acid, 喹喔啉-2-甲酸，QC)。他們預(yù)測基因簇中的八個(gè)(Ecm2～Ecm4，Ecm8，Ecm11～Ecm14)[4]基因編碼完成從L-色氨酸到QC的轉(zhuǎn)化。

其次是環(huán)肽骨架的生物合成。QC被加載到由Ecm1、Ecm6、Ecm7編碼的多酶復(fù)合體并完成側(cè)鏈的延伸，由Ecm7編碼的NRPS上的Ecm TE催化兩條多肽鏈同源二聚化，后面再經(jīng)過環(huán)化，使得兩條肽鏈間的游離巰基空間距離變的更近，經(jīng)過Ecm7 NRPS氧化后，形成3(Triostin A，三骨菌素A)，最后一步，在Ecm18 NRPS中的S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下二硫鍵變?yōu)榱蚩s醛結(jié)構(gòu)4。并且證明了(2S，3S)β-羥基色氨酸是一個(gè)關(guān)鍵的中間體。

在生色團(tuán)合成過程中，有多種特殊功能的蛋白也參與其中。例如ecm8編碼的一種類MbtH蛋白(MbtH-like protein, MLP)[9]對NRPS復(fù)合體中腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(adenylation, A)的可溶性表達(dá)/活性至關(guān)重要[10]，而后者直接影響NRPS合成過程中氨基酸的加載。張晨等[3,11]研究細(xì)胞色素P450羥化酶對游離的L-色氨酸有無作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，此羥化酶僅催化已加載到NRPS蛋白的色氨酸殘基進(jìn)行β-羥化。

通過對棘霉素生物合成機(jī)制的研究，不僅能夠了解這類天然活性化合物的代謝過程，還能夠通過對合成途徑進(jìn)行改造，構(gòu)建模式生物和天然產(chǎn)物化合物庫[7,12]。

2 棘霉素的作用機(jī)制

棘霉素平面結(jié)構(gòu)中包含兩個(gè)能嵌入DNA的生色團(tuán)，因此被稱為DNA的雙嵌入劑。棘霉素與DNA的這種結(jié)合是其生物活性的基礎(chǔ)。早期研究中，認(rèn)為棘霉素與DNA的結(jié)合沒有特異性，后來大量X射線衍射[13]、DNA印記和核磁共振波譜實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對富含GC位點(diǎn)的DNA有結(jié)合偏好，這與其他嵌入劑如三骨菌素A和luzopeptin A不同，他們對富含AT位點(diǎn)的DNA有結(jié)合偏好。

在當(dāng)棘霉素與DNA結(jié)合后，會抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II[14]，DNA解旋酶[15]和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶[16]的活性，從而抑制DNA的復(fù)制和RNA的生物合成。當(dāng)棘霉素結(jié)合的DNA位點(diǎn)為啟動子結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，不同結(jié)合部位還能引起不同的生物現(xiàn)象，例如棘霉素能夠特異性抑制HIF-1與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)啟動子中內(nèi)源性乏氧應(yīng)答元件的結(jié)合[17]，從而抑制乏氧對VEGF mRNA誘導(dǎo)表達(dá)的作用。

3 棘霉素在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用

基于棘霉素與生物大分子(核酸和蛋白質(zhì))的直接結(jié)合作用的應(yīng)用。

圖1 棘霉素分子結(jié)構(gòu)

圖2 棘霉素生物合成簡圖

Wu等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，棘霉素對T:T錯(cuò)配隔斷的富含GC的位點(diǎn)有偏好結(jié)合，并且其錯(cuò)配修復(fù)缺陷腫瘤細(xì)胞抑制作用更強(qiáng)，棘霉素的這一特點(diǎn)未來或許可以用于錯(cuò)配修復(fù)缺陷腫瘤的診斷和治療。DNA雜交生物芯片能實(shí)現(xiàn)不同環(huán)境下感染因子的精確檢測，Hakan等[19]在研發(fā)這種芯片時(shí)發(fā)現(xiàn)棘霉素與DNA作用能產(chǎn)生氧化信號，并且這種信號強(qiáng)于腺嘌呤和鳥嘌呤產(chǎn)生的信號，棘霉素的引入極大的提高了DNA雜交檢測的靈敏度。Joan等[20]根據(jù)棘霉素與ACGT位點(diǎn)選擇性結(jié)合[21]這一特點(diǎn)，運(yùn)用漲落定理(fluctuation theorems)研究結(jié)合反應(yīng)中能量變化、選擇性和變構(gòu)效應(yīng)。

棘霉素不僅能與核酸結(jié)合，還能與與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體。Singh等[22]運(yùn)用表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)技術(shù)，證實(shí)棘霉素能夠與FKBP12(FK506 binding protein 12, FKBP12)結(jié)合，影響mTOR信號通路活性。這也許也是棘霉素抗腫瘤作用的一條信號通路。

4 棘霉素在抗腫瘤等方面的應(yīng)用

4.1 棘霉素的抗腫瘤作用

Cha等[23]在研究HIF-1α對甲狀腺乳頭狀癌腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)他們選擇的四種HIF-1α抑制劑中，棘霉素抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成作用最強(qiáng)，在裸鼠動物實(shí)驗(yàn)中，手術(shù)剝離瘤塊＋棘霉素化療組也顯示出最高的存活率。Ahn等[24]在舌癌動物模型中發(fā)現(xiàn)，HIF-1手術(shù)前后靶向化療能顯著延小鼠的生存時(shí)間。Wan等[25]在研究乏氧對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤遷移有無影響時(shí)，運(yùn)用棘霉素作為HIF-1的小分子抑制劑，抑制乏氧誘導(dǎo)的Drp1蛋白表達(dá)，證明了Drp1蛋白參與乏氧對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251誘導(dǎo)遷移過程。Thangasamy等[26]在研究乏氧誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞侵襲作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，HIF-1能夠與RON啟動子結(jié)合，而棘霉素能夠調(diào)低RON基因的表達(dá)，從而使RON介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞侵襲作用減弱。

Wang等[27]在腫瘤干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，盡管腫瘤干細(xì)胞與正常干細(xì)胞有相似性，棘霉素卻能夠選擇性抑制腫瘤干細(xì)胞的克隆形成，而不影響骨髓中造血母細(xì)胞的克隆形成。這種對腫瘤干細(xì)胞的選擇性，也許能夠降低其副作用。隨后，他們在研究急性骨髓性白血病時(shí)發(fā)現(xiàn)，棘霉素能夠靶向白血病起始細(xì)胞，而對造血干細(xì)胞沒有影響[28]。Ponnurangam等[29]在胰腺癌干細(xì)胞(Cancer stem cells,CSCs)的研究中發(fā)現(xiàn)，棘霉素能顯著抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生長，并且顯著降低CSCs蛋白標(biāo)志物的水平。

4.2 棘霉素的其它應(yīng)用

Janji?等[30-31]在研究乏氧和含羞草素對牙髓源性細(xì)胞血管生成素分泌的影響中，棘霉素能減弱細(xì)胞對含羞草素和乏氧的響應(yīng)能力，降低細(xì)胞內(nèi)血管生成素mRNA的水平。他們還運(yùn)用棘霉素研究牙髓源性細(xì)胞的核心生物鐘基因?qū)Ψρ鹾秃卟菟氐姆磻?yīng)性[32]，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞蛋白水平和mRNA水平對棘霉素的反應(yīng)性存在差異。

棘霉素還表現(xiàn)出顯著的抗瘧疾和抗原蟲活性[33-34]，它的抗瘧疾作用的IC50值比氯喹低100倍[35]。

5 棘霉素研究新趨向

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，棘霉素不僅能作用于DNA，更能作用于特定靶點(diǎn)，這其中以其對HIF-1的作用最為突出，大部分研究中，棘霉素都作為靶向HIF-1的抑制劑。有這種新的應(yīng)用前景，棘霉素也許能夠開發(fā)成靶向HIF-1的藥物。同時(shí)，通過對其生物合成過程的研究，構(gòu)建生物類似物庫，也許能從中發(fā)現(xiàn)毒性更小的化合物。通過對其抗腫瘤作用機(jī)制和應(yīng)用的研究，將來或許能找到更多的作用靶點(diǎn)。通過改變其給藥劑型，也許能夠降低其體內(nèi)毒性，在臨床研究中走的更遠(yuǎn)。