合萌水提物抗炎鎮(zhèn)痛作用的實驗研究

王 娟，胡 倩，劉 鈴，袁帶秀，余 浩

(吉首大學 醫(yī)學院，湖南 吉首416000)

合萌(AeschynomeneindicaLinn.)系一年生“水陸兩棲”草本或亞灌木狀植物，為豆科合萌屬合萌族，中藥名為梗通草，別名為田皂角、水皂角、水槐子等。民間習用其全草入藥。其味甘淡、寒，入脾、胃經，具有清熱利濕、祛風明目、通乳等作用，主治熱淋、血淋、水腫、排泄、痢疾、目赤腫痛、關節(jié)疼痛等癥狀[1]。迄今為止，已從合萌的種子、葉、莖等部位分離出了多種化合物，其中包括蒽醌及其甙類，黃酮及其甙類，黃烷醇及其甙類等[2]?，F(xiàn)代藥理學研究證實合萌提取物具有抑制多種致病細菌、抗炎、鎮(zhèn)痛和抗過敏作用[3]。本實驗進一步對其抗炎、鎮(zhèn)痛作用及其機制進行初步研究，以期為合萌的臨床應用和新藥開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品

合萌由植物資源與利用湖南省高校重點實驗室提供，由我院中藥學李春艷教授鑒定。地塞米松片，廣東華南藥業(yè)集團有限公司生產，批號151101；阿司匹林腸溶片，湖南新匯制藥股份有限公司山產，批號150606。

1.2 動物

昆明種小鼠(清潔級)，體質量18～22 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。動物按性別分籠，飼養(yǎng)于空調室內，室溫(22 ±2)℃，濕度(60 ± 5)%，喂標準顆粒飼料，自由飲水和攝食。

1.3 主要儀器與試劑

FA2204C電子分析天平(上海平軒科學儀器有限公司)，PL-200熱刺痛儀(成都泰盟)，YLS-Q耳腫打孔器(濟南益延科技發(fā)展有限公司)，7-6V分光光度計(南京菲勒儀器有限公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)試劑盒均由南京建成生物工程公司生產。

1.4 方法

1.4.1 供試樣品的制備

將合萌全草500 g干燥、粉碎，過篩，水煎3次，每次30 min，合并水煎液，濃縮為1 g/mL(生藥)，得到合萌水提物。

1.4.2 抗炎作用

1.4.2.1 耳廓腫脹實驗

取昆明種小鼠50只,雌雄各半，采用完全隨機分組法分為5組，每組10只。給藥組(合萌水提物高、中、低劑量組)分別灌胃給予合萌水煎液1.5、1.0、0.5 g/kg，陽性藥組灌胃給予地塞米松0.02 g/kg，空白對照組灌胃10 mL/kg蒸餾水。均每天1次，連續(xù)給藥7 d，末次給藥后0.5小時，在每只小鼠右耳正反面凃二甲苯0.05 mL致炎，左耳廓作為對照，1 h后，頸椎脫臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑8 mm打孔器在同一部位取下耳片，稱重，以左右耳片質量差值表示腫脹程度，計算小鼠耳朵腫脹度以及腫脹抑制率[4]。

腫脹度=右耳片質量-左耳片質量腫脹

抑制率=(空白對照組耳腫脹度-用藥組耳腫脹度)/空白對照照組耳腫脹度×100%

1.4.2.2 足趾腫脹實驗

取昆明種小鼠50只,雌雄各半，分組給藥同1.4.2.1，末次給藥后1 h，在每只小鼠右側足趾皮下注射1.0%角叉菜膠30 μL致炎，并于致炎后再灌胃給予相應藥物1次，次日處死小鼠，剪取雙后足精確稱量，以右足的重量減去左足的重量作為足趾炎性腫脹度，計算小鼠足趾炎腫脹度以及腫脹抑制度[5]。

腫脹度=右后足質量-左后足質量

腫脹抑制度=(空白對照組足趾腫脹度-用藥組足趾腫脹度)/空白對照組足趾腫脹度×100%

1.4.2.3 小鼠腹腔毛細血管通透性實驗

取昆明種小鼠50只,雌雄各半，分組給藥同1.4.2.1，末次給藥后1 h，按0.1 mL/10g小鼠尾靜脈注射0.5%伊文思藍溶液，立即腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只；20 min后處死小鼠，用5 mL生理鹽水沖洗小鼠腹腔，收集沖洗液，3 000 r/min，離心15 min，取上清液于分光光度計590 nm處比色，測定吸光度值(A)[6]。

1.4.3 鎮(zhèn)痛作用

1.4.3.1 醋酸扭體實驗

取昆明種小鼠50只，雌雄各半，采用完全隨機分組法分為5組，每組10只。給藥組(合萌水提物高、中、低劑量組)分別灌胃給予合萌水煎液1.5、1.0、0.5 g/kg，陽性藥組灌胃給予阿司匹林0.2 mg/kg，空白對照組灌胃10 mL/kg蒸餾水。末次給藥后1小時，各組小鼠分別腹腔注射0.7%醋酸溶液0.1mL/10g，觀察小鼠出現(xiàn)扭體反應的潛伏期及15 min內扭體反應的次數(shù)(以小鼠腹部凹陷、雙后肢伸展為扭體反應指標),計算扭體反應抑制率[7]。

抑制率=(空白對照組扭體反應次數(shù)-給藥組扭體反應次數(shù))/空白對照組扭體反應次數(shù))×100%

1.4.3.2 熱板實驗

選用昆明種雌性小鼠，熱板(55±0.5)℃，觀察小鼠出現(xiàn)舔足的潛伏期，作為痛閾指標，選擇痛閾在5～30 s的小鼠50只，采用完全隨機分組法分為5組。給藥組(合萌水提物高、中、低劑量組)分別灌胃給予合萌水煎液1.5、1.0、0.5 g/kg，陽性藥組灌胃給予阿司匹林0.2 mg/kg，空白對照組灌胃10 mL/kg蒸餾水。每組給藥前重復測定痛閾值，取2次痛閾平均值作為正常痛閾值，連續(xù)給藥7 d，每天1次。末次給藥后30、60、90、120 min分別測定各組小鼠痛閾值，如60 s內無反應的小鼠，應立即取出，以免燙傷，其痛閾值按60 s計算[8]。實驗結束后，眼眶取血，3000 r/min離心10 min，取血清檢測SOD活性、MDA和NO含量。

1.5 統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)

以±S表示，利用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，單因素方差分析，組間比較采用q比較。

2 結 果

2.1 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹作用的影響

由表1可知，合萌水提物高劑量組小鼠耳廓腫脹程度明顯低于空白對照組(P<0.05)，合萌中、低劑量組小鼠廓腫脹程度與空白對照組比較無顯著性差異，提示合萌高劑量能顯著抑制二甲苯致小鼠耳腫脹。

組別劑量(g/kg)耳腫脹度(mg)腫脹抑制率(%)空白對照組—8.25±1.16地塞米松組0.022.71±0.47a67.15%合萌高劑量組1.55.14±0.96b37.70%合萌中劑量組15.88±1.0128.73%合萌低劑量組0.57.00±0.9315.15%

注：與空白對照組比較，aP<0.01，bP<0.05

2.2 對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹作用的影響

由表2可見，合萌水提物高、中劑量均能明顯緩解角叉菜膠致小鼠足跖炎性腫脹，其抑制作用隨劑量的增加而增強；與空白對照組比較，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05，P<0.01)。

組別劑量(g/kg)足趾質量(mg)左足右足足趾腫脹度(mg)腫脹抑制率(%)空白對照組—169.0±10.39256.5±10.4387.5±11.03地塞米松組0.02150.2±6.82184.1±10.43a37.6±6.41a57.03%合萌高劑量組1.5169.0±10.2221.0±10.7953.2±4.77a39.20%合萌中劑量組1157.8±6.81215.0±9.31b59.3±4.94b32.23%合萌低劑量組0.5157.5±14.89223.6±22.6566.1±9.4124.46%

注：與空白對照組比較，aP<0.01，bP<0.05

2.3 對醋酸致小鼠毛細血管通透性的影響

由表3可知，合萌水提物高、中、低劑量均能明顯減少伊文思藍滲出量；與空白對照組比較，具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，提示合萌能顯著抑制醋酸致小鼠毛細血管通透性。

組別劑量(g/kg)OD值空白對照組—0.267±0.029地塞米松組0.020.079±0.007a合萌高劑量組1.50.101±0.016a合萌中劑量組10.124±0.009a合萌低劑量組0.50.160±0.024a

注：與空白對照組比較，aP<0.01，bP<0.05

2.4 對醋酸所致小鼠扭體反應的影響

由表4可知，合萌水提物高、中劑量均有鎮(zhèn)痛作用，且合萌水提物的高劑量的鎮(zhèn)痛效果與阿司匹林的鎮(zhèn)痛效果相當(P<0.01)。

組別劑量(g/kg)潛伏期(min)扭體次數(shù)(次/15 min)抑制率(%)空白對照組—2.86±0.3557.33±7.58阿司匹林組0.25.16±0.59a28.83±3.05a49.71%合萌高劑量組1.54.67±0.65b33.50±4.01a41.57%合萌中劑量組13.89±0.7038.00±6.64b33.72%合萌低劑量組0.53.29±0.4544.33±6.1722.68%

注：與空白對照組比較，aP<0.01，bP<0.05

2.5 對熱板所致小鼠疼痛反應的影響

由表5可見，合萌水提物高、中、低劑量組及阿司匹林組在給藥后均能顯著提高痛閾值(P<0.01)，相同時間與空白對照組比較，合萌水提物不同劑量組及阿司匹林組在提高痛閾值方面具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

2.6 合萌水提物對熱板實驗小鼠血清中SOD，MDA，NO的影響

由表6可知，與空白對照組比較，合萌水提物高劑量組和阿司匹林組均能顯著降低MDA含量，提高SOD活性，并能顯著抑制小鼠血清NO生成(P<0.05，P<0.01)。

組別劑量(g/kg)給藥前痛閾值/(s)給藥后痛閾值/(s)30 min60 min90 min120 min空白對照組—13.83±1.5415.00±2.5615.16±2.6914.67±2.6714.16±2.91阿司匹林組0.214.50±1.3839.50±2.68ac40.83±4.03ac42.16±4.14ac41.16±2.52ac合萌高劑量組1.515.50±2.4037.70±2.57ac40.16±3.91ac41.00±5.16ac40.83±2.41ac合萌中劑量組115.33±2.2836.20±2.52ac38.50±2.99ac38.60±0.68ac36.50±2.96ac合萌低劑量組0.514.83±1.7232.80±3.53ac36.00±2.70ac38.00±4.87ac35.33±2.93ac

注：與空白對照組比較，aP<0.01，bP<0.05；與給藥前比較，cP<0.01

組別劑量(g/kg)SOD(U/mL)MDA(nmol/mL)NO(μmol/L)空白對照組—107.6±19.1623.34±2.7594.54±21.18阿司匹林組0.2157.3±3.19b15.48±1.04a39.62±9.22b合萌高劑量組1.5151.8±9.19b16.37±1.49b45.10±8.36b合萌中劑量組1135.5±13.8619.23±2.0760.36±18.51合萌低劑量組0.5126.4±19.3819.65±1.5064.72±16.22

注：與空白對照組比較，aP<0.01，bP<0.05；與給藥前比較，cP<0.01

3 討 論

炎癥是機體組織對各種物理、化學、生物等損傷因子所發(fā)生的防御性反應，其局部反應主要包括紅、腫、熱、痛及功能障礙等[9]。事實證明，炎癥反應和疼痛常常相伴而生，并互相影響。文獻[10]報道，田皂角水提物可明顯抑制巴豆油所致小鼠耳廓腫脹，醋酸致小鼠扭體反應。本研究結果發(fā)現(xiàn)，合萌水提物可抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹、角叉菜膠所致的小鼠足跖腫脹的急性炎癥反應，而且其抑制作用呈量效關系；以伊文思藍滲出量為指標的小鼠毛細血管通透性的急性炎癥實驗中，合萌水提物能顯著抑制醋酸致小鼠毛細血管通透性伊文思藍的滲出量，抗炎實驗表明合萌具有顯著的抗炎作用。熱板法和醋酸扭體法鎮(zhèn)痛實驗表明，合萌水提物能延緩醋酸所致小鼠扭體的出現(xiàn)時間，減少扭體次數(shù)，而且呈現(xiàn)一定的量-效關系，劑量越大，扭體反應的潛伏期延長、次數(shù)減少，這表明合萌有抗炎性疼痛的藥理活性；合萌水提物能明顯延長熱刺激小鼠痛閾值，表明該合萌對溫度等物理因素導致的疼痛有鎮(zhèn)痛作用。