細(xì)菌脂蛋白生物合成調(diào)控研究進(jìn)展

賈雨晴 夏杰 張文軒 聞剛 馮波 連旭 薛文杰 吳松

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)與適藥化研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

細(xì)菌脂蛋白是一種脂質(zhì)修飾的膜蛋白，是革蘭陰性菌外膜和革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞被膜的重要組成成分[1]。脂蛋白在細(xì)菌的重要生理過(guò)程中如細(xì)胞膜的合成，營(yíng)養(yǎng)攝取，細(xì)胞壁代謝，細(xì)胞分裂，跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，孢子形成，抗生素耐藥性，物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)(如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng))以及蛋白質(zhì)的胞質(zhì)外折疊[2]發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)細(xì)菌的生存至關(guān)重要。對(duì)于病原菌來(lái)說(shuō)，脂蛋白既是細(xì)菌在復(fù)雜環(huán)境中生存的基礎(chǔ)，也常常是其致病不可或缺的毒力因子，直接參與病原菌的多種致病機(jī)制，如細(xì)菌定殖、入侵、逃避宿主防御和影響宿主免疫系統(tǒng)等[3-5]。脂蛋白基因普遍分布在細(xì)菌中，占細(xì)菌總基因組的1%～3%[6]。盡管細(xì)菌脂蛋白具有不同的來(lái)源、結(jié)構(gòu)和功能，但均具有Leu-(Ala/Ser)-(Gly/Ala)-Cys組成的稱為“l(fā)ipobox”的共識(shí)序列[7]。脂蛋白以前體形式在細(xì)胞質(zhì)中合成，通過(guò)Sec或Tat分泌系統(tǒng)首先被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)膜的外表面上，然后進(jìn)行脂蛋白的生物合成[8-9]。脂蛋白的經(jīng)典生物合成途徑包括以下步驟(圖1)：首先，二酰甘油基轉(zhuǎn)移酶(Lgt)識(shí)別原前脂蛋白保守序列中的半胱氨酸Cys，將磷脂酰甘油醇(PG)的二酰甘油基轉(zhuǎn)移至半胱氨酸的巰基上，形成二酰甘油基修飾的前脂蛋白。然后，脂蛋白信號(hào)肽酶Ⅱ(LspA)切除二酰甘油基-前脂蛋白的信號(hào)肽形成脂蛋白。最后，脂蛋白N-?；D(zhuǎn)移酶(Lnt)催化磷脂酰乙醇胺(PE)的?；溵D(zhuǎn)移到半胱氨酸的N末端，產(chǎn)生一個(gè)成熟的三?；鞍譡10]。其中Lgt和LspA存在于所有革蘭陰性和革蘭陽(yáng)性細(xì)菌中，而Lnt僅存在于革蘭陰性菌和高GC(鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶)含量的革蘭陽(yáng)性菌中。在低GC含量的革蘭陽(yáng)性菌中，脂蛋白多以二酰甘油基脂蛋白的形式存在，但仍有一些細(xì)菌中存在非經(jīng)典生物合成途徑，如枯草桿菌和金黃色葡萄球菌中，脂蛋白以三酰化脂蛋白形式存在[11-12]。正確的脂蛋白修飾以及該過(guò)程中所涉及到的酶對(duì)革蘭陰性菌和一些高GC含量的革蘭陽(yáng)性菌的活力至關(guān)重要。了解這些酶的催化機(jī)制，結(jié)構(gòu)和功能有助于發(fā)現(xiàn)針對(duì)這一重要途徑的新型抗生素。因此，本文中主要介紹了這3種酶的生物學(xué)功能和晶體結(jié)構(gòu)。

1 前脂蛋白二酰甘油基轉(zhuǎn)移酶Lgt

Lgt催化脂蛋白產(chǎn)生路徑的第一步反應(yīng)，能夠識(shí)別前脂蛋白“l(fā)ipobox”的共識(shí)序列[LVI]-3[ASTVI][GAS]C+1，從而將來(lái)自磷脂酰甘油醇(PG)的二酰甘油基轉(zhuǎn)移至lipobox序列中半胱氨酸殘基的巰基上[13]，形成二酰甘油基修飾的前脂蛋白。Lgt位于細(xì)胞內(nèi)膜中，是由lgt基因編碼形成的含有291個(gè)氨基酸(33kDa)的膜蛋白[14]，其最適反應(yīng)溫度為37℃，最適反應(yīng)pH為7.8[15]。大多數(shù)細(xì)菌含有一個(gè)單一的lgt基因，只有少數(shù)細(xì)菌有兩個(gè)或兩個(gè)以上的lgt同源基因[16]。Lgt對(duì)底物的識(shí)別具有特異性[17]，帶負(fù)電荷的磷脂酰甘油醇(PG)是最有效的二酰甘油基供體；另外兩種帶負(fù)電荷的磷脂酸(PA)和磷脂酰絲氨酸(PS)可作為低效的供體；中性磷脂，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰膽堿(PC)和二酰甘油基(DAG不能作為L(zhǎng)gt的底物)。最近對(duì)保守氨基酸殘基的分析，表明了Lgt特征序列的存在，并且該序列中的兩個(gè)氨基酸殘基(Asn146和Gly154)對(duì)于Lgt的功能是必不可少的[18]。另外，氨基酸殘基His103-Gly108以及Tyr26和Tyr235對(duì)于Lgt的功能也很重要[19]。Lgt功能的缺失，會(huì)導(dǎo)致革蘭陰性菌死亡，可能是由外膜脂蛋白的基本特性決定的[20]，如Yfio外膜蛋白是大腸埃希菌存活的必要組分。Lgt對(duì)于所有革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的體外生長(zhǎng)是非必要的，可能是某些前體脂蛋白具有與必需脂蛋白相同的功能[21-22]，例如PrsA脂蛋白是枯草芽孢桿菌中的必需蛋白質(zhì)，但該生物體的lgt突變體仍然能夠存活。但是Lgt功能的缺失會(huì)導(dǎo)致革蘭陽(yáng)性菌活力和致病能力的下降，例如枯草芽孢桿菌lgt突變體在細(xì)胞色素caa3活性[23]，蛋白質(zhì)分泌[22]，孢子形成[24]中表現(xiàn)出可與特定脂蛋白功能受損相關(guān)的缺陷。因此，Lgt是研發(fā)新一代廣譜型抗生素的潛在靶標(biāo)。2016年，Zhang課題組[10]解析出大腸埃希菌Lgt的蛋白結(jié)構(gòu)(圖2)，并確定了具有催化作用的氨基酸殘基。Lgt由7個(gè)跨膜螺旋(TM)組成，其N末端朝向細(xì)胞周質(zhì)，C末端朝向細(xì)胞質(zhì)，構(gòu)成了蛋白結(jié)構(gòu)的主體，此外，還有6個(gè)β-片層和4個(gè)α短螺旋。在跨膜螺旋TM4和TM5之間，4個(gè)扭曲的β片層(β1、β2、β4和β6)和2個(gè)α短螺旋(α3和α4)形成1個(gè)具有球形形狀的周質(zhì)頭部結(jié)構(gòu)域。此外，Lgt有兩條兩親性臂，一條是由跨膜螺旋TM1的N-末端β片層(β2和β3)形成的“臂-1”，一條位于TM2和TM3之間，由α1和η2(20個(gè)氨基酸殘基組成的短鏈)形成的“臂2”。跨膜螺旋TM2、TM3和“臂2”形成了一個(gè)小的跨膜結(jié)構(gòu)域，其余的跨膜螺旋則形成了主要的跨膜結(jié)構(gòu)域。對(duì)于Lgt功能很重要的氨基酸殘基His103-Gly108位于跨膜螺旋TM3的N-末端。在兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域之間有一個(gè)中心腔，該腔內(nèi)有兩個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)，第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是Glu151，第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是Arg143，該腔的底部(細(xì)胞質(zhì)側(cè))是完全疏水的，而上部(細(xì)胞周質(zhì)側(cè))由更多極性氨基酸殘基組成，與底物PG的分布取向一致。此外該中心腔有兩個(gè)(正面和側(cè)面)裂隙作為底物PG的潛在入口和釋放離去基團(tuán)的周質(zhì)出口。具有催化活性的氨基酸殘基Arg143和Arg239也位于該中心腔中，其對(duì)二酰甘油基的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。前脂蛋白的巰基可能對(duì)磷脂酰甘油醇的羰基進(jìn)行親核進(jìn)攻，其中Lgt提供催化殘基Arg143以支持二酰甘油基轉(zhuǎn)移到前體蛋白上，并將兩個(gè)底物靠近在一起，而Arg239通過(guò)與二酰甘油基(DAG)形成氫鍵，協(xié)同Arg143發(fā)揮作用。

圖1 脂蛋白產(chǎn)生途徑[10]Fig. 1 The canonical biosynthetic pathway of bacterial lipoproteins[10]

圖2 大腸埃希菌Lgt晶體結(jié)構(gòu)[10]Fig. 2 Crystalstructure of E. coil Lgt[10]

2 脂蛋白信號(hào)肽酶II LspA

LspA作用于脂蛋白產(chǎn)生途徑的第二步，通過(guò)切除前脂蛋白上半胱氨酸N末端的信號(hào)肽，形成脂蛋白。LspA是由169個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，普遍存在于細(xì)菌中，位于細(xì)胞質(zhì)膜上，其反應(yīng)適宜溫度37～45℃，最適反應(yīng)pH7.8[14]。盡管其缺少天冬氨酰蛋白酶的氨基酸共有序列Asp-Thr-Gly[25]，但是LspA被初步確定為天冬氨酰肽鏈內(nèi)切酶。在革蘭陰性菌中，LspA嚴(yán)格切除脂質(zhì)修飾的半胱氨酸殘基N-末端的信號(hào)肽，而一些革蘭陽(yáng)性菌的LspA可能對(duì)底物具有較低的特異性或不同的識(shí)別模式，如鏈球菌的LspA已被證明可以切割原前脂蛋白中未經(jīng)修飾的半胱氨酸殘基N末端的信號(hào)肽[26-27]。LspA是革蘭陰性菌中必需的酶。在革蘭陽(yáng)性菌中，LspA是非必需的，可能是因?yàn)長(zhǎng)spA突變菌株中前體脂蛋白的積聚導(dǎo)致其他肽酶的替代處理[28]，例如最近在糞腸球菌中發(fā)現(xiàn)了Eep肽酶，其參與了前體脂蛋白信號(hào)肽的切割過(guò)程。但LspA功能的缺失會(huì)導(dǎo)致革蘭陽(yáng)性菌致病能力的減弱[29]，例如，金黃色葡萄球菌LspA突變菌株毒力減弱。大部分細(xì)菌有一個(gè)單一lspA基因，只有少數(shù)細(xì)菌擁有兩個(gè)同源性的lspA基因，并且LspA與已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)沒(méi)有序列同源性，在人體中無(wú)同源類似物，使其成為潛在藥物靶點(diǎn)[30-33]。2016年，Caffery課題組[34]解析出銅綠假單胞菌LspA-Globomycin(格羅泊霉素)共晶結(jié)構(gòu)，并確定了其催化位點(diǎn)。LspA由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成(圖3a)，第一個(gè)結(jié)構(gòu)域由4個(gè)跨膜螺旋(MH1-4)組成，其N末端和C末端均在細(xì)胞質(zhì)中。第二個(gè)是細(xì)胞周質(zhì)結(jié)構(gòu)域，它由兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域所組成，其中較大的一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域是一個(gè)由4條肽鏈組成，兩親性的β-片層，位于細(xì)胞內(nèi)膜上。第二個(gè)亞結(jié)構(gòu)域由周質(zhì)螺旋(PH)組成，也位于細(xì)胞內(nèi)膜上，其長(zhǎng)軸正交于β-片層。LspA-Globomycin共晶結(jié)構(gòu)顯示，格羅泊霉素通過(guò)氫鍵以及疏水作用牢固的鑲嵌在LspA中，作用在跨膜螺旋MH1、MH2和MH3之間電子云密度獨(dú)特的環(huán)形區(qū)域，格羅泊霉素的Leu、Ile和Ser的主鏈羰基和LspA嚴(yán)格保守的氨基酸殘基Asn112和Arg116的側(cè)鏈形成氫鍵，而Leu的側(cè)鏈，羥基脂肪酸的乙酰基鏈與LspA非極性氨基酸殘基具有疏水相互作用。此外，格羅泊霉素Ser上的β-OH與LspA氨基酸殘基Asp143的羰基形成了最為顯著的氫鍵，Asp143是LspA催化二聯(lián)體中其中一個(gè)氨基酸殘基，另外一個(gè)是Asp124(圖3b)。LspA催化前體脂蛋白N-末端信號(hào)肽裂解的機(jī)制為：LspA的N端與二酰甘油基脂蛋白結(jié)合，起催化作用的天冬氨酸殘基Asp143、Asp124與水分子形成氫鍵來(lái)保持它所在的位置。當(dāng)遇到二酰甘油基脂蛋白時(shí)，Asp143協(xié)助水分子進(jìn)行親核進(jìn)攻，Asp124則是活化二酰甘油基脂蛋白肽鍵的羰基碳，形成四面體中間體。羰基碳上酰胺鍵的斷裂重排，導(dǎo)致前體脂蛋白N末端信號(hào)肽的斷裂。另外，對(duì)來(lái)自485個(gè)與銅綠假單胞菌的LspA具有35%～95%序列同源性的生物體進(jìn)行LspA氨基酸序列的推導(dǎo)，分析鑒定出LspA有14個(gè)嚴(yán)格保守的氨基酸殘基(Asp23、Lys27、Asn54、Gly56、Gly108、Ala109、Asn112、Arg116、Val122、Asp124、Phe139、Asn140、Ala142和Asp143)。

2.1 LspA抑制劑

2.1.1 格羅泊霉素(Globomycin)

1978年，格羅泊霉素(1)(圖4)首次被鑒定為由不同鏈霉菌菌株產(chǎn)生的對(duì)大腸埃希菌具有抑制活性的抗生素[35]。它是一個(gè)兩親性的19元環(huán)狀縮肽，由L-Ser和L-allo-Thr構(gòu)成了極性的一半，而羥基脂肪酸，L-Leu和L-Ile構(gòu)成了非極性的一半。動(dòng)力學(xué)研究表明，格羅泊霉素以非競(jìng)爭(zhēng)性抑制方式抑制LspA，其與二酰甘油基-前體脂蛋白的結(jié)合常數(shù)Ki為36nmol/L，米氏方程常數(shù)Km為6μmol/L[36]。其對(duì)LspA的EC50為2μg/mL[37]。格羅泊霉素對(duì)變形菌屬具有更好的抑制活性(但是對(duì)銅綠假單胞菌無(wú)活性)，對(duì)厚壁菌屬的抗菌活性較差[38-39]。對(duì)格羅泊霉素類似物的構(gòu)效關(guān)系研究表明，隨著羥基脂肪酸烷基側(cè)鏈的延長(zhǎng)，對(duì)革蘭陰性菌的抗菌活性也會(huì)隨之增強(qiáng)，可能是因?yàn)檩^長(zhǎng)的側(cè)鏈可以增強(qiáng)其與LspA跨膜螺旋 MH2非極性表面的疏水相互作用。并且隨著烷基側(cè)鏈延長(zhǎng)，其對(duì)一些革蘭陽(yáng)性菌(鏈球菌，金黃色葡萄球菌，腸球菌)表現(xiàn)出一定的抑制活性。L-Ser的羥基對(duì)于格羅泊霉素發(fā)揮抑制作用是必不可少的[39]，可能是其與關(guān)鍵氨基酸Asp143形成了氫鍵相互作用，阻斷了LspA的催化活性位點(diǎn)。

2.1.2 Myxovirescin(TA)

圖3 LspA-Globomycin共晶結(jié)構(gòu)[34]Fig. 3 LspA-globomycin complex structure[34]

抗生素TA(myxovirescin)(2)(圖4)是由黏細(xì)菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有28元大環(huán)內(nèi)酰胺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，是一種快速殺菌劑，具有廣譜抗菌活性。TA已被證明可以靶向LspA發(fā)揮抑制作用[37]，對(duì)LspA的EC50為0.25μg/mL。TA對(duì)大腸埃希菌YX127的最低抑菌濃度為0.25μg/mL，而格羅泊霉素對(duì)大腸埃希菌YX127的最低抑菌濃度為2μg/mL，TA比格羅泊霉素顯示出更好的LspA抑制活性及抗菌活性。由于TA對(duì)真菌，原生動(dòng)物，真核細(xì)胞，嚙齒動(dòng)物甚至人類沒(méi)有毒性，其抗菌活性是特異性的[40]。但是TA具有代謝不穩(wěn)定性，可將TA作為L(zhǎng)spA抑制劑的先導(dǎo)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

2.1.3 苯甲酰胺類化合物

2017年，Seiya等[41]報(bào)道了苯甲酰胺類化合物以非競(jìng)爭(zhēng)性方式抑制LspA的活性，初始苗頭化合物3a(圖4)是通過(guò)高通量篩選得到的，該化合物包含苯甲酰胺基和噻二唑結(jié)構(gòu)，對(duì)LspA的IC50為4.2μmol/L。通過(guò)對(duì)該化合物苯環(huán)上的甲氧基，噻二唑雜環(huán)，以及雜環(huán)上所連接的脂肪鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，得到了對(duì)LspA具有更強(qiáng)抑制作用的化合物3b，該化合物的IC50為99nmol/L。可能是由于革蘭陰性菌的外膜滲透性限制了該化合物的有效性，化合物3b必須在細(xì)胞外膜穿透劑多黏菌素衍生物PMBN存在下，才能抑制大腸埃希菌的生長(zhǎng)。在PMBN存在下，其對(duì)大腸埃希菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)為11μg/mL。此外，格羅泊霉素在PMBN存在下，對(duì)大腸埃希菌的抗菌活性增強(qiáng)了100倍。外膜滲透性是革蘭陰性抗生素藥物發(fā)現(xiàn)中的重要障礙，同時(shí)說(shuō)明了體外LspA抑制作用和體內(nèi)抗菌作用的差異。因此，LspA抑制劑和細(xì)胞外膜穿透劑或更多臨床相關(guān)的黏菌素或多黏菌素B的組合療法可能是增強(qiáng)LspA抑制劑體內(nèi)和臨床有效性的方法。

3 脂蛋白N-?；D(zhuǎn)移酶Lnt

Lnt是作用于脂蛋白產(chǎn)生過(guò)程中的最后一個(gè)酶，催化磷脂酰乙醇胺(PE)的sn-1-?；溵D(zhuǎn)移到脂蛋白半胱氨酸游離的α-氨基上，最終形成成熟的三?；鞍譡42-43]，成熟的脂蛋白停留在內(nèi)膜或被特定的脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外膜上，通過(guò)N端脂基團(tuán)錨定在膜上發(fā)揮其正常功能。在革蘭陰性菌中，脂蛋白正確的細(xì)胞定位是其發(fā)揮正常生理功能的基礎(chǔ)，這依賴于細(xì)胞內(nèi)脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，Lnt對(duì)脂蛋白從細(xì)胞質(zhì)膜釋放和通過(guò)脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到外膜是必不可少的。Lnt的缺失，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜中脂蛋白的積累，這對(duì)革蘭陰性菌來(lái)說(shuō)是致命的[44]。1991年，Gupta等[44]證實(shí)了大腸埃希菌Lnt位于細(xì)胞質(zhì)膜上，并且確定了其最適反應(yīng)pH(pH6.5～7.5)。2007年，Vidal-Vidal-Ingigliardi等[45]鑒定了Lnt的幾個(gè)主要的氨基酸殘基，它們主要位于起催化作用的周質(zhì)結(jié)構(gòu)區(qū)域，包括催化三聯(lián)體Glu267-Lys335-Cys387。該催化三聯(lián)體參與了兩步反應(yīng)：在第一步反應(yīng)中，Glu267充當(dāng)反應(yīng)過(guò)程的堿基，離去氫原子，活化Cys387，增強(qiáng)其親核性，進(jìn)攻磷脂sn-1脂肪酸鏈上的羰基，形成硫酯-中間體；在第二步反應(yīng)中，酰基轉(zhuǎn)移產(chǎn)生成熟的三?；鞍?，而Lys335用以穩(wěn)定在N-?；磻?yīng)兩個(gè)步驟中形成的四面體中間體的含氧陰離子[46-47]。動(dòng)力學(xué)研究顯示Lnt遵循乒乓(ping-pong)機(jī)制，由此在第一個(gè)反應(yīng)中產(chǎn)生的溶血磷脂副產(chǎn)物，在第二個(gè)底物脂蛋白結(jié)合和修飾之前釋放[47]。Lnt對(duì)磷脂底物有選擇性，具有sn-1飽和脂肪酸鏈(棕櫚酸酯或油酸酯)和sn-2不飽和脂肪酸鏈的磷脂酰乙醇胺是其最有效的供體[47]。2009年，Tschumi等[48-49]首次報(bào)道了Lnt在高GC含量放線菌屬中的活性，恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌的Lnt直系同源物具有N-?；D(zhuǎn)移酶活性，出乎意料地是，恥垢分枝桿菌脂蛋白的N-?；舅岱N類和脂肪酸在磷脂中的位置分布表明[50]，其Lnt的底物應(yīng)該來(lái)自PE的sn-2位置。這種特異性不同于大腸埃希菌Lnt底物來(lái)自PE的sn-1位置[51]，而對(duì)大腸埃希菌Lnt功能必需的氨基酸殘基Try237和Lys388，在恥垢分枝桿菌的Lnt中不存在[52]，這些氨基酸殘基被證明參與第二步的反應(yīng)，載脂蛋白的N-?；?，表明它們可能在底物特異性中起作用[53]。在所有的鏈霉菌屬中，含有兩種lnt基因(lnt1和lnt2)，在疥瘡菌屬中，lnt1基因?qū)τ贚nt的N-?；D(zhuǎn)移功能至關(guān)重要，而lnt2基因?qū)nt的功能不太重要，在lnt2基因不存在下，仍能產(chǎn)生成熟的三?；鞍譡54]。綜上，Lnt對(duì)于革蘭陰性菌和一些高GC含量放線菌屬的存活十分重要。因此，Lnt可作為廣譜抗生素的潛在靶標(biāo)。2017年，Sharookn課題組[55]解析出野生型大腸埃希菌Lnt蛋白結(jié)構(gòu)(圖5)，其由八條跨膜螺旋組成，N末端和C末端均位于細(xì)胞質(zhì)中。TM3在氨基酸殘基Gly71中含有明顯的扭結(jié)，側(cè)鏈間的相互作用導(dǎo)致TM4和TM5具有相似的跨膜角度，TM4和TM5在內(nèi)膜的外小葉附近稍微張開(kāi)以形成通向Lnt周質(zhì)結(jié)構(gòu)域的溝槽。除了一個(gè)短的兩親性螺旋(Lys161-Gly168)在TM6之前靠在膜周質(zhì)側(cè)，這些跨膜螺旋之間的大環(huán)(W141-V169)主要嵌入膜中。這些螺旋和介于它們之間的環(huán)形成一個(gè)小的親水性腔體。在跨膜螺旋TM7和8之間，具有一個(gè)大的特征性的α-β-β-α夾心折疊的周質(zhì)碳-氮水解酶結(jié)構(gòu)域，它由一個(gè)大的水解酶家族組成，包括腈基水解酶，酰胺水解酶，N-?；D(zhuǎn)移酶。其催化三聯(lián)體Glu267-Lys335-Cys387位于該水解酶區(qū)域。

圖4 LspA抑制劑(1、2、3a和3b)的結(jié)構(gòu)Fig. 4 Structures of LspA inhibitors (1, 2, 3a and 3b)

圖5 野生型大腸埃希菌Lnt晶體結(jié)構(gòu)[55]Fig. 5 Crystalstructure of wild-type Lnt[55]

4 結(jié)論與展望

隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥性，因此研發(fā)新作用機(jī)制的抗生素有望克服細(xì)菌耐藥性問(wèn)題。脂蛋白生物合成途徑的Lgt和LspA，Lnt酶是原核生物特有的，干擾該合成途徑將影響大量脂蛋白的合成，因此脂蛋白的生物合成途徑所涉及的3種酶可以作為抗生素發(fā)展的潛在靶標(biāo)。目前的臨床耐藥機(jī)制對(duì)作用于新靶標(biāo)的抗生素可能不存在交叉耐藥性。此外，Lgt、LspA和Lnt這3種酶都是跨膜蛋白，這種結(jié)構(gòu)可以使得一些小分子與它們結(jié)合，抑制它們的活性而不需要穿過(guò)難以滲透的細(xì)胞質(zhì)膜，從而提高抗菌有效性。目前這3種酶的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)均已被解析出來(lái)，從而可以開(kāi)展基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)，加快抗耐藥菌藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)。但是，目前針對(duì)脂蛋白的生物合成路徑所涉及的3種酶抑制劑，少有文獻(xiàn)報(bào)道。已報(bào)道的LspA抑制劑仍處于臨床前研究，其具體作用機(jī)理仍需進(jìn)一步探究。