蘆丁通過(guò)Notch信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖

高蕊 何東寧 王亞帝 李琪 陳素賢

(錦州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州 121001；2附屬第一醫(yī)院)

結(jié)腸癌是一種高發(fā)的惡性腫瘤，發(fā)病率呈上升態(tài)勢(shì)，在部分發(fā)達(dá)國(guó)家已排在惡性腫瘤第二位〔1，2〕。Notch信號(hào)通路是涉及細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程的一條重要信號(hào)通路，Notch主要表達(dá)于正常結(jié)腸的干細(xì)胞區(qū)，參與結(jié)腸細(xì)胞的自我更新及增殖、分化等過(guò)程。本研究旨在探討Notch信號(hào)通路在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，并研究蘆丁對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及Notch信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人結(jié)腸癌組織切片由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬三院病理科提供。SW480細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2主要試劑 蘆丁，鄭州荔諾生物科技有限公司；Notch-1抗體，Abcam公司；通用SP試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清，Gibco公司；胰蛋白酶，Invitrogen公司；噻唑藍(lán)(MTT)，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；Notch-1引物，Hes-1引物，GAPDH引物北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒，北京鼎國(guó)昌盛生物技有限術(shù)公司。

1.3主要儀器 Strata Gene Mx3000P熒光實(shí)時(shí)定量分析系統(tǒng)，Agilent Technologies；Mini-Protean小垂直板電泳系統(tǒng)，Bio-Rad Laboratories Inc；SpectraMax Plus384微孔板檢測(cè)系統(tǒng)，Molecular Devices；ECLIPSE 80i 顯微鏡，Nikon Instruments Inc。

1.4免疫組化法檢測(cè)人結(jié)腸癌組織中Notch-1的表達(dá)情況 選取結(jié)腸癌組織共50例，其中高分化型15例，中分化28例，低分化7例，患者均無(wú)術(shù)前放化療及其他治療史。選取癌旁切緣組織(距腫瘤組織>5 cm)作為正常對(duì)照。組織石蠟切片經(jīng)脫水、抗原修復(fù)后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相應(yīng)操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色、復(fù)染、脫水、透明后封片，顯微鏡下拍照后采用Image Pro-Plus6.0分析其平均光密度值(IOD/Area)。

1.5MTT檢測(cè)蘆丁對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響 預(yù)實(shí)驗(yàn)：設(shè)置蘆丁濃度為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μmol/L進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，給藥24 h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，確定蘆丁最終應(yīng)用濃度。正式實(shí)驗(yàn)：設(shè)置5個(gè)藥物濃度，計(jì)算蘆丁的半抑制濃度(IC50)。根據(jù)IC50值設(shè)置后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用蘆丁濃度劑量。以上實(shí)驗(yàn)中均以等體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液設(shè)置正常增殖對(duì)照(即蘆丁濃度為0.00 μmol/L)。

1.6檢測(cè)蘆丁對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Notch-1、Hes-1表達(dá)水平的影響 結(jié)腸癌細(xì)胞接種于6孔板，蘆丁設(shè)置3個(gè)劑量組(10、20、40 μmol/L)與條件培養(yǎng)基作用24 h后，收集細(xì)胞。分別采用Realtime PCR及Western 印跡技術(shù)檢測(cè)蘆丁作用結(jié)腸癌細(xì)胞24 h后細(xì)胞中Notch-1、Hes-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)均以等體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液設(shè)置正常增殖對(duì)照(即蘆丁濃度為0 μmol/L)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1人結(jié)腸癌組織中Notch-1的表達(dá)水平 結(jié)腸癌組織中Notch-1陽(yáng)性染色相較于癌旁正常組織明顯增多，IOD/Area顯著升高(0.095±0.024 vs 0.023±0.013，P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 結(jié)腸癌組織及癌旁組織Notch-1陽(yáng)性染色(DAB，×200)

2.2蘆丁對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘆丁的IC50在10-6～10-4數(shù)量級(jí)。蘆丁濃度為0.00、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μmol/L，抑制率分別為0.00%、27.55%、30.76%、44.53%、48.02%、58.74%。因此設(shè)置蘆丁濃度為0、5、15、45、135、405 μmol/L進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，MTT測(cè)定細(xì)胞增殖情況，OD值分別為1.178±0.120、0.675±0.103、0.648±0.113、0.561±0.086、0.473±0.083、0.280±0.070。利用GraphPad Prism軟件計(jì)算得到蘆丁對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的IC50值為22.34 μmol/L。

2.3蘆丁對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Notch信號(hào)mRNA水平的影響 與0 μmol/L比較，蘆丁10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L濃度組細(xì)胞中Notch-1、Hes-1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),見(jiàn)表1。

2.4蘆丁對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中Notch信號(hào)蛋白表達(dá)水平的影響 與0 μmol/L比較，蘆丁10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L濃度組細(xì)胞中Notch-1、Hes-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),見(jiàn)表1、圖2。

圖2 蘆丁不同濃度組Notch-1、Hes-1蛋白表達(dá)

3 討 論

Notch信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異?？赡軙?huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生〔3〕。研究證實(shí)，Notch信號(hào)通路在T淋巴細(xì)胞白血病、胰腺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌及前列腺癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào)〔4～8〕。在鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)Notch-1出現(xiàn)失活性突變；在皮膚角質(zhì)細(xì)胞中Notch具有明顯的腫瘤抑制作用，Notch可以保護(hù)皮膚角質(zhì)細(xì)胞抵抗化學(xué)或紫外線引起的癌變〔9～12〕。上述研究表明，Notch可能具有促癌/抑癌的雙重作用，Notch信號(hào)通路在腫瘤中生物作用可能具有細(xì)胞和組織特異性。Notch主要表達(dá)于正常結(jié)腸干細(xì)胞區(qū)，參與結(jié)腸細(xì)胞的自我更新及增殖、分化等過(guò)程〔13〕。

研究表明，蘆丁的藥理作用機(jī)制主要涉及抵抗氧化應(yīng)激、影響炎癥信號(hào)分子的表達(dá)及調(diào)控細(xì)胞凋亡等方面〔14～18〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘆丁可以明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。在正常結(jié)腸組織中，Notch信號(hào)主要表達(dá)于干細(xì)胞區(qū)。Notch-1信號(hào)通路最明確的分子靶點(diǎn)是Hes-1，幾乎所有Notch信號(hào)系統(tǒng)研究中都普遍存在Hes或HEY家族基因的轉(zhuǎn)錄激活。Hes是轉(zhuǎn)錄家族bHLH的成員，在人類(lèi)組織中主要表達(dá)Hes1-7。Hes與神經(jīng)發(fā)育、體節(jié)發(fā)育、骨骼發(fā)育、T淋巴細(xì)胞發(fā)育、癌癥等方面密切相關(guān)。研究表明，Hes-1的表達(dá)與干細(xì)胞標(biāo)志物(CD133、CD44、ALDH1、Bmi-1、Oct4和Sox2)呈正相關(guān)〔19〕。由此推斷，Notch-1可以作用于Hes-1轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)結(jié)腸細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘆丁可以顯著下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中Notch-1、Hes-1的表達(dá)水平，表明蘆丁可以通過(guò)抑制Notch-1與Hes-1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖分化途徑實(shí)現(xiàn)結(jié)腸癌治療作用。