桑黃活性物質研究現(xiàn)狀*

許 謙，周文欣，王 沖，李 倩，孫盟悅，焦新新，婁潔潔，張龍祥

（菏澤學院 農(nóng)業(yè)與生物工程學院，山東 菏澤 274015）

1 藥用真菌桑黃的研究現(xiàn)狀

桑黃（Pellinus igniarius）屬于擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）的藥用真菌[1]。菌蓋寬3 cm～12 cm，子實體早期呈茶色，之后變暗；中期呈扁半球型或者是馬蹄形，較大，栓質，堅硬；老時皮殼脫落，干裂，與自身菌肉顏色相同，硬，木質，上端逐漸變尖。主要生長于桑樹、柳樹、楊樹等闊葉樹的樹樁和樹身上，倒木上也有生長。桑黃在東亞分布廣泛，在中國很多省份都有生長。

涂成榮等[2]文獻記載培養(yǎng)基成分及比例與品種關系較大，需要不斷摸索篩選適合各品種生產(chǎn)的配方；且桑黃利用液體發(fā)酵技術進行?；a(chǎn)已取得初步成功。

2 主要化學成分研究現(xiàn)狀

2.1 子實體的主要化學成分研究現(xiàn)狀

桑黃子實體中活性物質的抗腫瘤和抗氧化等功效顯著，因此對桑黃子實體主要化學成分的研究對桑黃功能的開發(fā)和利用具有重要意義。錢驊等[3]發(fā)現(xiàn)桑黃子實體抗氧化的功效成分主要是多酚類物質及黃酮類化合物。在相同質量濃度下，對以不同方式提取的桑黃活性物質進行抗氧化活性實驗；抗氧化活性依次為醇提物>醇沉上清干物>水提取>粗多糖。同時證明多糖濃度與抗氧化活性之間不是正線性相關。

丁云云等[4]利用硅膠、柱色譜以及硅膠薄層制備色譜等方法，對桑黃的95%乙醇提取物進行分離純化。從中獲得到11個化合物，其中有4個是首次在桑黃中發(fā)現(xiàn)，分別為3α-羥基木栓烷-2-酮、3-羥基木栓烷-3-烯-2-酮、尿嘧啶核苷、4-（3，4-二羥苯基）-3-丁烯-2-酮。

2.2 菌絲體及培養(yǎng)液的主要化學成分研究現(xiàn)狀

桑黃具有抗腫瘤、抑菌及抗氧化等功效，但由于資源稀少，所以研究桑黃規(guī)?；囵B(yǎng)的技術成為當今對其研究的熱點之一。李月英等[5]采用熱水提取法來提取桑黃菌絲體多糖，通過實驗結果得出影響桑黃菌絲體多糖提取率的三個主要因素對其影響程度的大小為：提取時間>提取溫度>料液比。通過采用L9（34）正交試驗得出最優(yōu)桑黃菌絲體多糖的提取方案，平均提取率在此提取方案下達到6.64%。

許謙[6]采用四因素三水平正交試驗，得到使桑黃菌絲體生物量和胞外活性物質多糖產(chǎn)量顯著提高的培養(yǎng)基配方，該工藝為A3B1C3D2（麥麩10%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.35%、MgSO40.15%），pH為6；在該工藝下使菌絲體生物量和胞外活性物質多糖產(chǎn)率達到1.0077 g·100-1·mL-1，優(yōu)化后的配方使菌絲體產(chǎn)量顯著提高，可用于工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。

劉凡等[7]通過液體發(fā)酵技術得到桑黃菌絲體提取物，并對其進行抑菌活性及結構穩(wěn)定性的試驗。在不同pH值的條件下，桑黃菌絲體的甲醇提取物及乙酸乙酯萃取部在不同抑菌活性大小如表1所示，表明在堿性環(huán)境中，桑黃菌絲體的提取物抑菌效果較差，推測該結果可能因為堿性環(huán)境破壞了桑黃菌絲體某些與抑菌活性有關的結構。

表1 桑黃菌絲體提取物在不同pH值下抑菌活性的變化Tab.1 Changes of antibacterial activity of mycelium extract of Pellinus igniarius under different pH values

許謙[8]研究發(fā)現(xiàn)桑黃對各種營養(yǎng)物質利用順序有顯著差異，淀粉、半纖維素最先被利用，其次是果膠、纖維素及木質素。該研究對桑黃培養(yǎng)基的優(yōu)化具有指導性的意義。

韓東岐[9]等對桑黃纖孔菌發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物進行分離純化，從中獲得12個化合物，均為首次在桑黃纖孔菌中發(fā)現(xiàn)，對桑黃發(fā)酵液化學成分的研究具有重要意義。鄒湘月[10]等發(fā)現(xiàn)桑枝水提取物對桑黃菌絲體的生長和活性物質的含量及在菌絲體內(nèi)的積累均呈正相關。對研究菌絲生長及活性物質的含量等具有重要參考價值。

3 桑黃活性物質的組成

3.1 黃酮類成分的研究現(xiàn)狀

黃酮類活性物質屬于多酚類化合物，其主要存在于天然植被中。經(jīng)研究表明，黃酮在擴張血管、防止細胞衰老、降低血脂血糖以及增加免疫力等方面有重要作用。

彭真福等[11]采用乙醇回流的方法從桑黃提取多糖后的殘渣中提取黃酮類成分。通過單因素試驗和正交試驗得出最佳的生產(chǎn)方案為溫度90℃，時間4 h，料液比1∶30，乙醇體積分數(shù)60%。在該生產(chǎn)工藝下黃酮的提取率達到5.12%，劉凡等[12]對野生、人工栽培以及液體發(fā)酵培養(yǎng)的桑黃進行總黃酮類物質含量及體外活性物質的功效進行研究，發(fā)現(xiàn)人工栽培及液體發(fā)酵培養(yǎng)桑黃總黃酮類活性物質的產(chǎn)量和體外活性物質的功效均不及野生桑黃。但由于野生桑黃稀缺，人工栽培和液體培養(yǎng)的桑黃可以彌補這一不足。

3.2 多糖的研究現(xiàn)狀

真菌藥物的主要活性成分之一就是真菌多糖，廣泛存在于子實體、菌絲和發(fā)酵液中。由于其特殊的結構和良好的生理活性，使真菌多糖成為目前研究和開發(fā)及利用的熱門方向。目前對桑黃多糖的研究主要是多糖的提取方法、功效和一級結構的分析，而尋找大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)桑黃多糖的工藝和高活性多糖類藥物將是接下來研究的主要方向[13]。

牟珍珍等[14]通過研究表明山東桑樹桑黃總多糖的單糖組分為木糖、半乳糖、葡萄糖和乳糖。李樂等[15]采用低溫低壓的方法來提取桑黃活性多糖，這種方法不僅獲得大量桑黃活性多糖，還能在最大程度上保護桑黃活性多糖的結構，使提取的桑黃活性多糖抗氧化能力能夠達到較高水平。

3.3 萜類物質的研究現(xiàn)狀

大型真菌萜類化合物具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗菌、抗氧化等功效，對醫(yī)學上多種疾病的臨床治療具有重要意義。因此，大型真菌中萜類化合物研究是當前非常熱門的研究方向之一[16]。目前，許多三萜類化合物已作為一種天然抗癌藥物應用于部分中藥處方中。但是，關于三萜類化合物的研究相對較少，其特異作用范圍、藥理作用也有待進一步探討[17]。

近年來，從桑黃菌中分離得到的萜類化合物包括倍半萜、二萜以及三萜等。許謙[18]通過正交試驗配方對桑黃液體培養(yǎng)基進行優(yōu)化，使其能夠在較短時間內(nèi)獲得較多的三萜類化合物。降低了生產(chǎn)成本，使工廠化生產(chǎn)的利潤增加。

楊樹江等[19]使用超聲波儀輔助提取靈芝中的三萜類化合物，經(jīng)過酸化、萃取和氮吹的方法進行處理后，在使用紫外分光光度計進行檢測，能夠大大縮短檢測靈芝三萜類化合物的時間。張林芳[20]等通過大孔樹脂對桑黃總三萜進行分離純化發(fā)現(xiàn)獲得總三萜的濃度要比之前提高5倍，并確定D101大孔樹脂是目前分離及純化桑黃總三萜的最佳方法。

4 桑黃活性物質結構的研究現(xiàn)狀

真菌多糖是一種特殊的、具有復雜多樣的生物活性的物質，具有多種保健功能。近年來，許多科研人員對桑黃子實體多糖的結構進行研究。陸續(xù)從中分離出了數(shù)十種多糖，如單一多糖P60wl、PI11、PI21、PI31，水溶性多糖PRP，粗多糖EPS，蛋白多糖P1B等。各種多糖之間有著不同的分子結構特點。

4.1 多糖P1B結構特征

李波[21]等利用紅外光譜，見圖1。

對桑黃菌絲體多糖P1B組分進行定性分析，測定結果如下所述：結果顯示在紅外光譜2 928 cm-1和1 414 cm-1處產(chǎn)生多處吸收峰，烷烴的X-H的伸縮振動區(qū)在此區(qū)間，說明P1B中具有烷基的C-H鍵[22]。C=O伸縮振動的紅外光譜特征吸收峰出現(xiàn)在1 900 cm-1～1 650 cm-1，P1B紅外光譜顯示1 636 cm-1有吸收峰，說明P1B具有C=O的結構[23]。實驗證明吡喃糖的紅外光譜分析中在1 200 cm-1～1 000 cm-1有3個特征吸收峰[24]。P1B在此處有1 152 cm-1、1 080 cm-1、1 013 cm-1三個吸收峰，說明 P1B 屬于吡喃糖；糖醛酸的紅外特征吸收峰為1 730 cm-1～1 259 cm-1，P1B紅外光譜顯示顯示在1 730 cm-1和1 259 cm-1之間沒有吸收峰，說明P1B不含酸性多糖。

圖1 P1B的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum of P1B

魏靜等[25]從桑黃菌絲體中分離純化多糖P1B組分后，對其組成進行定性分析，單糖標準品出峰時間如圖2，鼠李糖16.598 min、阿拉伯糖16.831 min、甘露糖21.161 min、葡萄糖21.386 min、半乳糖21.521 min。利用同樣條件，對桑黃菌絲體多糖樣品進行測定，其出峰時間與標準品相比較，證實多糖P1B樣品組分為鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖，如圖3所示。

4.2 粗多糖EPS的結構特征

何培新等[26]對發(fā)酵罐發(fā)酵桑黃所產(chǎn)的粗多糖EPS分離純化后，采用羧甲基瓊脂糖凝膠CL-6B對其成分進行了研究，測定成分為Fr-I和 Fr-II。利用標準曲線法測定Fr-I和Fr-II的相對分子質量，結果顯示Fr-I的相對分子質量為6.27×105，F(xiàn)r-II的相對分子質量為5.5×104。

圖2 單糖標準品的GC-MS 圖Fig.2 GC-MS diagram of monosaccharide standard products

圖3 P1B中保留時間24 min左右的物質的GC-MS圖Fig.3 GC-MS diagram of substances retained for about 24min in P1B

除上述研究成果外，需注意不同的品種和菌絲體與子實體原材料不同可能會出現(xiàn)不同的多糖提取物。許謙[27]利用Sevage法將桑黃菌絲體中的蛋白質沉淀而多糖不沉淀，隨后運用TLC技術對干燥的脫蛋白多糖組分進行初步分離、鑒定。結果顯示，單糖組成有 D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和D-乳糖。這與魏靜等[25]測定的多糖組分為鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖，有較大的差異。

5 桑黃活性物質功能研究現(xiàn)狀

5.1 抗腫瘤功能

桑黃真菌能增強人體的免疫力，可激活T淋巴細胞，殺死腫瘤細胞的嵌合抗體，抑制腫瘤細胞的增殖。劉燕琳等[28]以肉瘤S180為材料，對桑黃真菌的抑瘤作用做了相關對照實驗。實驗發(fā)現(xiàn)桑黃真菌能調節(jié)PTEN基因與C-myc基因的表達水平，這是其實現(xiàn)抗腫瘤功能的途徑之一。PTEN基因可以調控某種抑制腫瘤蛋白因子的合成。多種腫瘤的出現(xiàn)都與C-myc基因有關，如肺癌、結腸癌、乳腺癌等，C-myc基因表達過度可使細胞無限增殖傳代，發(fā)生癌變。結果顯示，與對照組相比加入桑黃多糖濃度多或少均對PTEN基因表達起正調節(jié)作用。當加入濃度小于0.05 μm時，對C-myc基因的表達起負調節(jié)作用。

李有貴等[29]選用體外培養(yǎng)的腫瘤細胞為材料，對桑黃子實體中的多酚類組分進行抗腫瘤功能測定。將分離純化的多酚類物質配置成1∶10的活性成分液體，把腫瘤細胞放入其中培養(yǎng)，48 h后取出觀察，結果顯示腫瘤細胞的死亡率達到50%以上。

5.2 抑菌、抗炎能力

桑黃的發(fā)酵產(chǎn)物可降低大多微生物的活性或阻止其繁殖，發(fā)酵產(chǎn)物可通過多種有機溶劑提取，如：乙酸乙酯萃、甲醇、石油醚等。但不同溶劑提取物的抑菌效果有所差異，劉凡等[12]對其抑菌作用進行比較，結果顯示，與空白組二甲基亞砜相比較，不同溶劑提取物對常見的五類菌群金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌、沙門氏菌都有較好的抑制作用，其中甲醇提取物對五類菌群的抑制作用最顯著，70%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物和水提取物對五類菌群的抑制作用相仿。

程建安等[30]向小鼠腹腔注射藥物二甲苯，使其耳朵腫脹。把桑黃菌絲體粉碎后，進行浸泡、煎煮。將煎煮液連續(xù)3 d灌胃給小鼠，結果表明：桑黃菌絲體煎煮液對小鼠耳朵的腫脹有明顯的抑制作用。綜上所述，桑黃菌絲體具有一定的抑菌、抗炎能力。

5.3 抗氧化能力

體內(nèi)自由基如果清理不及時，會造成一定的傷害如加速衰老，出現(xiàn)癌癥等。研究表明，桑黃在液體培養(yǎng)過程中可分泌多種抗氧化性質物質，如酚、黃酮以及還含有類似于白藜蘆醇衍生物L-組氨酸和1，2-二羥基苯結構的物質，這些物質可消除自由基對人體的不利影響。多酚分泌量最多，具有很強的抗氧化性，一是可消除鐵、銅等金屬離子催化作用，二是可鰲合金屬離子。

桑黃菌絲體也有較強的超氧陰離子清除能力和自由基清除能力，鄭飛等[31]研究表明，桑黃菌絲體對羥自由基的抑制能力與菌株的生長代謝處的旺盛時期呈正相關，在第4天、第8天達到最大；對超氧陰離子的清除能力與其代謝能力也呈正相關，第8天、第10天效果最強；對DPPH自由基也有較強的清除能力，但隨培養(yǎng)時間的增加清除能力逐漸減弱。自由基清除能力和DPPH自由基清除變化如圖4、圖5所示。

圖4 自由基清除能力變化圖Fig.4 Change of free radical scavenging capacity

圖5 DPPH自由基清除變化圖Fig.5 DPPH radical scavenging changes

桑黃菌絲對超氧陰離子清除效果受多種因素影響，主要表現(xiàn)在培養(yǎng)時間上。應瑞峰[32]等對不同生長期的菌絲多糖的抗氧化能力進行測定。測定結果顯示，在一定范圍內(nèi)，桑黃菌絲的抗氧化性與培養(yǎng)時間呈正相關，但桑黃子實體多糖抗氧化性最佳，其次是3個月多糖、6個月多糖。

5.4 增強免疫力

李志濤等[33]提取桑黃菌絲體后，進行了動物免疫實驗，實驗證明桑黃菌絲體多糖能有效地加強小白鼠的免疫力，并且在一定范圍內(nèi)，免疫力與桑黃用量呈正相關。以桑黃菌絲體多糖濃度為橫坐標，以小白鼠免疫活性為縱坐標，繪制桑黃菌絲多糖用量與免疫活性變化趨勢，如圖6所示。

圖6 桑黃菌絲多糖用量對小鼠細胞免疫活性的影響變化圖Fig.6 Changes of mycelial polysaccharide dosage of Pellinus igniarius mycelium on immune activity of mouse cells

5.5 美容、抗衰老

自由基與機體衰老有著密切相關，可調節(jié)和保持我們機體的健康。沈雪梅等[34]利用紫外，在517 nm左右波長處測得桑黃醇提物對DPPH有強吸收；水提物對穩(wěn)定的自由基具有較好的清除作用，且清除作用隨其濃度的增大而增大。總之，桑黃具有美容養(yǎng)顏、延緩衰老的功能。

5.6 其他功效

除上述功能外，周洪英等[35]發(fā)現(xiàn)火木針層孔菌能直接下調急性毒性4-硝基鄰苯二胺和疊氮鈉血液培養(yǎng)基的誘變，間接下調有機合成時2-氨基芴的誘變；研究證明桑黃真菌也具抗血管生成、降血糖[36]、癖飲，脾虛泄瀉等功能。