PMP 柱前衍生化HPLC 法測定黃秋葵多糖的單糖組成

周彥強(qiáng)，吳光斌*，陳發(fā)河

（集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361000）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus L.）屬于錦葵科植物，起源于非洲[1]，在上個世紀(jì)90年代引入我國，目前在全國多個地區(qū)均有栽培，產(chǎn)量較高[2]。黃秋葵嫩莢中含有豐富的黏性多糖物質(zhì)，主要是由果膠類多糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖及少量糖蛋白組成[3]。果膠多糖是一種可溶性纖維，它能促進(jìn)機(jī)體內(nèi)毒素的排泄，降低血糖及膽固醇的含量，也具有一定的抗腫瘤作用[4]。黃秋葵的水溶性果膠具有較高的黏性，前人對其流變學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)單元和乳化性等做了部分研究。Kontogiorgos等[1]研究黃秋葵流變學(xué)特性，結(jié)果顯示具有明顯的剪切稀化現(xiàn)象；Sengkhamparn等[5]研究黃秋葵結(jié)構(gòu)單元，發(fā)現(xiàn)包含一種特殊的α鍵連接的鼠李糖-半乳糖交替單元；Georgiadis等[6]研究黃秋葵水包油乳液的流變學(xué)特性和穩(wěn)定性，認(rèn)為其具有作為乳化劑的潛力。黃秋葵的水溶性果膠還具有類似脂肪的性質(zhì)，已經(jīng)被用作脂類的替代物[7]，還有研究稱這種特殊黏液可用來制備Lepidimoide（一種類植物激素，屬于寡糖類生物活性物質(zhì)）[8]。

多糖中單糖組分的分析，通常需要用三氟乙酸將多糖降解成單糖再進(jìn)行測定。目前單糖的檢測方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氣相色譜法及高效陰離子交換色譜安培檢測法等[9]。薄層色譜法具有操作方便、設(shè)備簡單、無需衍生化的特點(diǎn)，但是其靈敏度低，分離效果差，僅適用于簡單多糖的定性分析。氣相色譜法分離效能高、測定快速、靈敏度高；Sengkhamparn等[10]使用氣相色譜法分析了黃秋葵多糖的單糖組成。但是糖類化合物和多元醇揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性較低、沸點(diǎn)高，需對其衍生化后才能用氣相色譜法進(jìn)行分析，而氣相色譜法的單糖衍生化反應(yīng)操作十分復(fù)雜，容易產(chǎn)生異構(gòu)體，也容易受樣品雜質(zhì)的干擾，誤差較大。高效陰離子交換色譜安培檢測法是糖類技術(shù)分析較為理想的方法，它利用糖類化合物的電化學(xué)活潑性，單糖可在強(qiáng)堿溶液中呈離子化狀態(tài)，因此可以使用強(qiáng)堿溶液作為流動相通過陰離子交換從而達(dá)到分離效果。潘媛媛等[11]利用此法分析了啤酒和麥汁中的單糖組分，但該法的缺點(diǎn)是分析過程中需要使用較高pH值的流動相，對設(shè)備的要求較高，價格昂貴，并且較低的柱容也限制了后續(xù)的分析操作。HPLC法用于單糖組成分析時具有分離速度快、分辨率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。單糖可以直接使用HPLC法結(jié)合通用型檢測器進(jìn)行分析。裘雅漁等[12]使用高效液相體積排阻色譜法配合示差折光檢測器分析黃秋葵多糖的單糖組成。劉曉霞[3]使用HPLC配合示差折光檢測器分析黃秋葵花中果膠類多糖的單糖組成。但是通用型示差折光檢測器靈敏度低，檢測限也較高；而另一種通用型檢測器蒸發(fā)光散射檢測器價格昂貴且檢測步驟繁瑣。單糖分子本身缺少發(fā)色基團(tuán)，無法直接使用紫外或熒光檢測器，因此一定程度上限制了單糖的分析檢測。有研究將多糖水解后的單糖用發(fā)光試劑衍生后再利用HPLC法分離和檢測[13-17]，其原理是1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-menthy-5-pyrazolone，PMP）可以在堿性條件下與單糖定量縮合成PMP-單糖衍生物，該物質(zhì)較為穩(wěn)定并在波長250 nm處有較強(qiáng)的光吸收[18-20]，這使得紫外檢測器可以應(yīng)用于單糖的分析。本實(shí)驗(yàn)將順序提取的3 種不同黃秋葵多糖經(jīng)過酸高溫水解為單糖，研究PMP柱前衍生化HPLC法測定黃秋葵多糖的單糖組成的分析方法，旨在為黃秋葵多糖的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃秋葵購自廈門市集美區(qū)永輝超市，樣品購買后去蒂去籽，置于－75 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

鼠李糖、葡萄糖醛酸（均為色譜純） 北京索萊寶科技有限公司；甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖（均為分析純）、NaOH、HCl、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；巖藻糖（分析純） 美國Aladdin公司；乙腈（色譜純）、PMP（純度≥99.9%） 美國Sigma公司；三氟乙酸（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司。標(biāo)準(zhǔn)品純度均不小于98%。

1.2 儀器與設(shè)備

2695 HPLC儀（配Waters 2489紫外檢測器） 美國Waters公司；PE20K型pH計、LE204E電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；RIOS 8超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；WB-14恒溫水浴鍋 德國Memmert公司；ULT1386 －80 ℃超低溫冰箱 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.85）：配制0.1 mol/L 磷酸氫鈉和0.1 mol/L磷酸二氫鈉，混合后調(diào)整pH值至6.85；單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液：配制質(zhì)量濃度在1.0～1.7 mg/L內(nèi)的8 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、巖藻糖），4 ℃保存1 周；混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取適量的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液混合，然后用超純水稀釋至2、4、8、16、32、64 倍，得到梯度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 黃秋葵多糖的提取

將黃秋葵冷凍干燥后粉碎，稱取黃秋葵粉末10.0 g，再分別使用70%乙醇溶液洗滌（料液比1∶10（g/mL））2 次、三氯甲烷-甲醇溶液（1∶1，V/V）洗滌（料液比1∶15（g/mL））3 次、丙酮洗滌（料液比1∶10（g/mL））2 次，然后烘干，得到醇不溶固形物（alcohol-insoluble solid，AIS）。

使用3 種不同的緩沖溶液對AIS進(jìn)行順序提取。每種緩沖液重復(fù)提取多次至提取液中的總糖質(zhì)量濃度低于50 μg/mL，總糖含量的測定使用苯酚-硫酸法[21]。緩沖溶液1為醋酸鹽緩沖液（pH 5.2，0.05 mol/L），料液比1∶60（g/mL），70 ℃提取30 min得到熱水浸提物（hot buffer soluble solution，HBSS）提取液；緩沖溶液2為草酸鈉（0.05 mol/L）、EDTA·2Na（0.05 mol/L）和醋酸鈉（0.05 mol/L）的混合溶液，料液比1∶60（g/mL），70 ℃提取30 min得到螯合劑浸提物（chelating agent soluble solution，CHSS）溶液；緩沖液3為NaOH（0.05 mol/L）和硼氫化鈉（0.02 mol/L）的混合溶液，料液比1∶60（g/mL），70 ℃提取30 min得到堿提物（dilute alkaline soluble solution，DASS）溶液。

將得到的HBSS、CHSS和DASS溶液使用Sevag溶液（氯仿-正丁醇，5∶1，V/V）反復(fù)處理脫去蛋白質(zhì)；然后透析48 h脫鹽，期間換水6 次；旋蒸濃縮后冷凍干燥，得到HBSS、CHSS和DASS多糖樣品。

1.3.3 多糖樣品的水解

稱取多糖樣品固體10.0 mg于離心管中，加2 mol/L的三氟乙酸2 mL，氮?dú)夥饪诤笥?10 ℃水解5 h，旋干水解后的溶液，再利用甲醇洗滌后旋干，繼續(xù)重復(fù)3 次除去殘留的三氟乙酸，最后加入10.0 mL蒸餾水得到1.0 mg/mL的樣品水解溶液。

1.3.4 衍生處理

取多糖樣品的水解液或單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL于試管中，加入0.3 mol/L NaOH溶液500 μL，混合后加入0.5 mol/L PMP-甲醇溶液500 μL，混勻后70 ℃水浴60 min，冷卻后加入0.3 mol/L HCl溶液500 μL中和NaOH；然后加氯仿1 mL渦旋30 s，離心后吸棄氯仿層，繼續(xù)重復(fù)萃取2 次以除去多余的PMP，最后過0.22 μm微孔膜備用。

1.3.5 HPLC條件

InfinityLab Poroahell C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，4 μm）；檢測波長250 nm；柱溫25 ℃；上樣量20 μL；流速1 mL/min；流動相為磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.85）-乙腈（82∶18，V/V）；洗脫方式為等度洗脫。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016軟件和Empower 2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用Adobe 3d Reviewer軟件和Empower 2軟件對圖像進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

考察Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Xbridge Amide C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）和InfinityLab Poroahell C18柱（4.6 mm×150 mm，4 μm），在磷酸鹽（pH 6.75）-乙腈溶液（82∶18，V/V）條件下的分離效果。結(jié)果顯示，Xbridge Amide C18的效果較差，其中半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的分離度均小于1.2；而Symmetry C18和InfinityLab Poroahell C18柱均具有良好的分離效果，8 種單糖組分的分離度均大于1.5。又因InfinityLab Poroahell C18柱的柱長為150 mm，其分析時間短，節(jié)省流動相，因此實(shí)驗(yàn)選用InfinityLab Poroahell C18柱。

2.2 流動相體系的選擇

以磷酸鹽緩沖液-乙腈為流動相反相分離PMP-醛糖衍生物時，緩沖液的pH值和乙腈的比例是重要的影響因素。相關(guān)文獻(xiàn)選用的pH值大多為6.6～6.9[22-24]。實(shí)驗(yàn)先使用磷酸鹽緩沖液（pH 6.75）-乙腈作流動相，考察乙腈比例分別為16%、17%、18%、19%、20%對單糖衍生物的分離效果。結(jié)果表明，乙腈比例越少，8 種單糖的分離度越大，分析時間越長，而PMP的出峰時間受影響較小，這與林欽恒等[25]的研究結(jié)果基本一致。當(dāng)乙腈比例小于18%時，8 種單糖的分離度均大于1.5，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察緩沖液的pH值分別為6.65、6.75、6.85、6.95時對8 種單糖的保留時間及分離效果的影響。結(jié)果表明，增大pH值可以縮短分析時間，但是過高的pH值會使糖醛酸的出峰時間相對提前，導(dǎo)致葡萄糖醛酸與鼠李糖有重合現(xiàn)象，分離度降低，這與張曉[26]的研究結(jié)果基本一致；當(dāng)使用磷酸鹽（pH 6.85）緩沖液-乙腈（82∶18，V/V）溶液進(jìn)行洗脫時，8 種單糖的分離效果良好，分離度均大于1.5。因此本實(shí)驗(yàn)最終選用磷酸鹽緩沖液（pH 6.85）-乙腈（82∶18，V/V）溶液作為流動相。在上述優(yōu)化的色譜條件下對標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行測定，如圖1所示。

圖1 8 種單糖標(biāo)品（A）、HBSS（B）、CHSS（C）和DASS（D）色譜圖Fig. 1 HPLC profiles of mixed eight monosaccharide standards and three polysaccharides

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限測定結(jié)果

將梯度濃度的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.4節(jié)步驟衍生，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測定。以各單糖組分的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（y）與相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)信噪比確定檢出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）。如表1所示，8 種單糖的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0，說明線性關(guān)系良好；8 種單糖的檢出限為0.13～0.45 mg/kg，定量限為0.43～1.49 mg/kg。

表1 單糖組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges, limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) for monosaccharides by HPLC

2.4 回收率與精密度測定結(jié)果

在超純水中分別加入高中低3 個水平的混標(biāo)，按照1.3.4節(jié)方法進(jìn)行處理，各加標(biāo)水平平行測定6 次，計算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，見表2。結(jié)果表明，8 種單糖的加標(biāo)回收率為94.51%～106.44%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，說明該檢測方法準(zhǔn)確度好、精密度高。

表2 單糖組分的空白加標(biāo)回收率（n=6）Table 2 Average recoveries of monosaccharides in spiked pure water (n= 6)

2.5 樣品的測定

表3 3 種樣品的單糖含量（n=3）Table 3 Monosaccharide composition of three samples (n= 3)

利用本方法對3 種樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。樣品HBSS中含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其物質(zhì)的量比為0.1∶7.0∶0.4∶5.8∶0.9∶14.6∶1.5；樣品CHSS中含有鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖，其物質(zhì)的量比為4.7∶61.8∶9.6∶5.3，樣品DASS中含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其物質(zhì)的量比為9.5∶5.4∶1.3∶10.8∶2.4∶7.6。

3 討 論

果膠中含量較高的結(jié)構(gòu)是半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖I（rhamnogalacturonan I，RG I）和鼠李半乳糖醛酸聚糖II （rhamnogalacturonan II，RG II）。其中RG II的分子鏈較小，并且通常連接于HG的末端，所以在果膠中的含量也較少。對不同植物、植物不同器官或植物細(xì)胞中不同位置的果膠，其HG和RG I的比例也不相同[27]。HG結(jié)構(gòu)的主鏈?zhǔn)前肴樘侨┧?；而RG I結(jié)構(gòu)的主鏈?zhǔn)鞘罄钐呛桶肴樘侨┧岬慕惶娼Y(jié)構(gòu)，2 種單糖的比例為1∶1。根據(jù)Alba等[28]的研究，單糖的物質(zhì)的量比可以反映果膠分子結(jié)構(gòu)包括支鏈上的差異。使用不同的溶液對黃秋葵進(jìn)行提取可以得到不同組分的多糖，這可能與多糖在細(xì)胞內(nèi)的存在位置或者多糖與其他物質(zhì)的結(jié)合方式有關(guān)[1,4,29]。使用熱水浸提得到的HBSS應(yīng)該是黃秋葵細(xì)胞中游離于細(xì)胞質(zhì)或者與細(xì)胞壁結(jié)合不緊密的多糖，其中高物質(zhì)的量比的鼠李糖說明其具有很高比例的RG I結(jié)構(gòu)，大量的半乳糖說明其分子鏈具有較多的分支結(jié)構(gòu)；使用螯合劑提取得到的CHSS應(yīng)該是黃秋葵細(xì)胞中以離子鍵結(jié)合到細(xì)胞壁上的多糖，其中具有高比例的半乳糖醛酸，說明其中的果膠結(jié)構(gòu)主要為HG結(jié)構(gòu)，這與螯合劑對離子鍵的破壞有關(guān)；DASS的提取過程使用堿溶液和還原劑，這可能會破壞部分共價鍵，其結(jié)構(gòu)與HBSS類似，但是其中出現(xiàn)了較多的阿拉伯糖[10]。

此外，根據(jù)樣品的測定結(jié)果，此提取方法可以得到不同結(jié)構(gòu)的多糖，實(shí)現(xiàn)多糖的粗分離效果，其主要體現(xiàn)在HBSS和CHSS上。在果膠類多糖中，其酸性和中性糖的差異主要體現(xiàn)在半乳糖醛酸的含量上。對熱水浸提后的AIS，使用螯合劑（EDTA和草酸鹽）可以屏蔽掉鈣離子，這部分半乳糖醛酸含量較高的多糖便被提取出來。此法可以一次性分離得到大量的粗多糖，同時具有速度快的優(yōu)點(diǎn)。Coimbra等[30]也根據(jù)類似的原理進(jìn)行了橄欖果多糖的分離。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立PMP柱前衍生HPLC法分析黃秋葵多糖的單糖組成的方法，測定從黃秋葵中順序提取的3 種不同多糖的單糖組成，確定其物質(zhì)的量比，樣品HBSS中，甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=0.1∶7.0∶0.4∶5.8∶0.9∶14.6∶1.5；樣品CHSS中，鼠李糖∶半乳糖醛酸∶半乳糖∶阿拉伯糖=4.7∶61.8∶9.6∶5.3；樣品DASS中，甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=9.5∶5.4∶1.3∶10.8∶2.4∶7.6。該方法不僅目標(biāo)物響應(yīng)值高、干擾低、穩(wěn)定，而且與其他方法相比，其檢出限更低，準(zhǔn)確度和精密度好，靈敏度和回收率高，操作簡便，可用于黃秋葵多糖組成的分析，亦可為其他植物材料多糖組成研究提供參考。