4 種香辛料提取物對豬肉肌原纖維蛋白抗氧化特性的影響

陳洪生，牛百慧，劉 歡，李艷青，張瑞紅，孔保華*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是肌肉中最豐富的蛋白質(zhì)，是肌纖維的重要組成部分。氧化會使蛋白更易發(fā)生熱變性，并可導(dǎo)致蛋白的理化特性和功能特性下降[1-5]。在肉類工業(yè)中，通常使用天然的或合成的抗氧化劑控制肉制品中氧化反應(yīng)的進程，但人工合成的抗氧化劑由于存在食品安全問題而受到了一定的限制[6-8]。本課題以豬肉MP為研究對象，在前期對14 種香辛料提取物抗氧化效果篩選的研究基礎(chǔ)上，選擇4 種抗氧化效果最好的提取物，即：丁香提取物（clove extract，CE）、迷迭香提取物（rosmary extract，RE）、桂皮提取物（cinnamon extract，CME）和甘草提取物（lcorice extract，LE）。分別添加不同質(zhì)量濃度的香辛料提取物，然后采用羥自由基氧化體系，模擬肉本身或貯藏條件下存在的促進氧化的因素，對豬肉MP進行不同程度的氧化，通過分析羰基含量、巰基含量、Ca-ATP酶活性、溶解性和表面疏水性等指標(biāo)的變化，明確香辛料提取物對MP氧化的控制作用，這對于肉品在貯藏或流通中通過抑制蛋白氧化來保持蛋白質(zhì)的功能特性具有非常重要的意義[9-12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬品種為三元豬，購于雙匯肉業(yè)，宰后12 h內(nèi)取背最長??；香辛料 市購。

牛血清白蛋白、2,4-二硝基苯肼、5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）、1,4-哌嗪二乙磺酸（1,4-piperazinebis(ethanesulp honic acid)，PIPES）、8-苯氨基-奈酚-磺酸（1-anilino naphthalene-8-sulfonic acid，ANS）、Trolox（VE衍生物）（均為分析純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

N-1000型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；T18 basic型高速勻漿機 德國IKA公司；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；SPECORD 200 PLUS紫外-可見分光光度計 德國耶拿分析儀器股份公司；F4500熒光分光光度計 日本日立有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香辛料提取物的制備

參照Zhang Huiyun等[13]的提取方法。首先將購買的香辛料置于鼓風(fēng)干燥箱中45 ℃烘干，然后經(jīng)超微細粉碎機粉碎，準(zhǔn)確稱取50 g干粉置于500 mL燒瓶中，加400 mL 95%食用乙醇溶液與其充分混合，然后在55 ℃恒溫搖床100 r/min振蕩提取12 h，用Whatman No.2濾紙過濾，取下殘渣加入200 mL食用乙醇再次提取12 h后再過濾。合并所有濾液后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50 ℃濃縮，取出濃縮液40 ℃、0.07 MPa真空干燥24 h，最后將4 種香辛料提取物冷凍干燥，得到終產(chǎn)物為膠黏狀半固體，保存于－20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 豬肌肉蛋白質(zhì)的提取

將豬背最長肌垂直于肌纖維方向切成50～100 g的肉片，根據(jù)Park等[14]的方法提取MP并稍作修改，提取液由10 mmol/L磷酸鹽、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA組成，pH值為7.0，冷卻至4 ℃后使用，洗液用0.1 mol/L NaCl溶液冷卻至4 ℃后使用。MP的提取在4 ℃條件下完成，提取流程如圖1所示。

圖1 MP提取流程圖Fig. 1 Flow chart of MP extraction

1.3.3 香辛料提取物的添加與MP的氧化

Fe-H2O2-抗壞血酸為羥自由基產(chǎn)生氧化系統(tǒng)，可以產(chǎn)生活性氧自由基，由FeCl3、抗壞血酸和H2O2通過鐵的氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生[15]。本實驗采用10 μmol/L FeCl3、100 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L H2O2，作為MP的氧化體系；用含0.6 mol/L NaCl的15 mmol/L PIPES緩沖液（pH 6.25）將提取的MP稀釋為20 mg/mL，4 種香辛料提取物的添加量分別為0、0.1、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL，然后使用氧化體系于4 ℃分別氧化0、1、3、5 h。最后通過添加PG-Trolox-EDTA-2Na（1 mmol/L）終止氧化反應(yīng)。對照采用未加氧化劑，但含有PG-Trolox-EDTA-2Na的蛋白溶液。在各項指標(biāo)測定中，使用含0.6 mol/L NaCl的15 mmol/L PIPES緩沖液（pH 6.25）將蛋白稀釋至相應(yīng)的質(zhì)量濃度進行測定。

1.3.4 羰基含量的測定

根據(jù)Chen Lin等[16]的方法稍作修改。取1 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的MP溶液置于塑料離心管中，每管中加入1 mL濃度為10 mmol/L的2,4-二硝基苯肼溶液 ，室溫條件下反應(yīng)1 h，期間每5 min旋渦振蕩1 次，然后添加1 mL 20%三氯乙酸溶液，10 000 r/min離心5 min，棄清液，用1 mL乙酸乙酯-乙醇（1∶1，V/V）溶液清洗沉淀3 次除去未反應(yīng)的試劑，加3 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶液，置于37 ℃水浴保溫15 min以溶解沉淀，10 000 r/min離心3 min后除去不溶物質(zhì)，所得物在370 nm波長處測吸光度。用22 000 L/（mol·cm）作為摩爾消光系數(shù)計算羰基含量，羰基含量表示為每克MP羰基物質(zhì)的量（μmol/g）；蛋白含量用雙縮脲法測定，用牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 蛋白質(zhì)Ca-ATP酶活性的測定

根據(jù)Wells[17]和Katoh[18]等的方法進行豬MP的Ca-ATP酶活性的測定，MP質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL，酶活性用每克蛋白中含有無機磷物質(zhì)的量（mmol/g）表示。一系列濃度的磷酸二氫鈉（0.0～1.0 mmol/L）作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算磷酸鹽含量。磷酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.456X＋0.000 9，R2=0.999 5。

Ca-ATP酶活性的測定：取0.2 mL質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL 的MP溶液，加入2 mL Ca-ATPase反應(yīng)液（7.6 mmol/L ATP、15 mmol/L CaCl2·2H2O、150 mmol/L KCl、180 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4），25 ℃反應(yīng)10 min（20 ℃需反應(yīng)25 min），然后加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，再于7 500 r/min離心5 min除去沉淀，取1.0 mL上清液加入3.0 mL 0.66%的鉬酸銨（溶解于0.375 mol/L硫酸溶液中），充分混合后加入0.5 mL新配制的10% FeSO4溶液，反應(yīng)2 min后，于700 nm波長處測定吸光度。

1.3.6 表面疏水性的測定

按照Chen Lin等[19]的方法并稍作改動。首先將制備好的MP樣品分散在0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）中，配制成2 mg/mL的MP溶液，然后通過添加不同量的緩沖溶液，將每個樣品分別稀釋成0.1、0.5、1、5、10、15 mg/mL 6 個梯度，然后再取每個樣品的不同質(zhì)量濃度的稀釋液4 mL與50 μL 8 mmol/L ANS溶液混合，最后以熒光強度為縱坐標(biāo)，6 個質(zhì)量濃度梯度為橫坐標(biāo)，所得曲線的斜率即為表面疏水性。

1.3.7 巰基含量的測定

根據(jù)Zhang Ziye等[20]的Ellman試劑法，測定蛋白質(zhì)的巰基含量。取1 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的MP溶液與8 mL Tris-甘氨酸溶液（0.09 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.004 mol/L EDTA和8 mol/L尿素，pH 8.0）混合，充分混勻后加入1 mL Ellman’s試劑（每毫升含4 mg 5.5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）），置于黑暗處反應(yīng)30 min后，于波長412 nm處測定吸光度，使用摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計算巰基含量。對照組不加蛋白溶液，其他處理方法相同。

1.3.8 蛋白溶解性的測定

依據(jù)Benjakul等[21]的方法并稍作改動。稱取豬MP 1 g溶解于18 mL 0.6 mol/L KCl溶液中，混合勻漿30 s，勻漿液在室溫條件下攪拌溶解4 h，然后4 ℃、8 500×g冷凍離心30 min。取10 mL上清液溶解于冷的0.5 g/mL三氯乙酸溶液中，使最終體積分數(shù)為10%。離心所得沉淀物用0.1 g/mL的三氯乙酸溶液清洗后，溶解在0.5 mol/L NaOH溶液中。MP樣品也直接溶解于0.5 mol/L NaOH溶液中，作為總蛋白含量。最后用雙縮脲法測定上清液中的蛋白含量。MP的溶解程度用溶解性表示，按下式計算：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種香辛料提取物對不同氧化時間MP羰基含量的影響

圖2 不同質(zhì)量濃度的4 種香辛料提取物對不同氧化時間MP羰基含量的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of four spice extracts on MP carbonyl content at different time points of oxidation

羰基的形成是蛋白質(zhì)發(fā)生氧化的一項最顯著的變化[22]。蛋白質(zhì)側(cè)鏈中含有NH2—或NH—基團，這些基團對氧化十分敏感，氧化后連接這些基團的碳原子上很容易形成羰基[23]。如圖2A所示，未氧化肌肉的蛋白羰基含量為0.7 μmol/g，氧化5 h后羰基含量增加到2.4 μmol/g。CE的添加顯著抑制了羰基的形成（P＜0.05），且隨CE質(zhì)量濃度的增加抗氧化作用明顯增強。氧化5 h時，與對照組相比添加0.1、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL CE組的羰基含量分別下降了16.04%、21.39%和44.07%（P＜0.05），添加RE組的羰基含量分別下降了8.28%、19.67%和23.80% （P＜0.05），添加CME組的羰基含量分別下降了4.56%、15.35%和18.67%（P＜0.05），添加LE組的羰基含量下降不顯著（P＞0.05）。盡管其他3 種香辛料提取物也不同程度地抑制了羰基含量的增加，但CE的抑制效果最好，其次是RE和CME，因此對氧化引起羰基含量增加的控制能力為CE＞RE＞CME，LE的作用不顯著。

2.2 4 種香辛料提取物對不同氧化時間MP的Ca-ATP酶活性的影響

Ca-ATP酶活性的變化，突出顯示了蛋白質(zhì)氧化的物理和化學(xué)本質(zhì)。Ca-ATPase酶活性與球蛋白頭部的活性巰基緊密相關(guān)，且經(jīng)常作為肌球蛋白完整性的指示器[24]。主要包括2 個活性巰基基團，SH1和SH2，即Cys707和Cys697，它們位于肌球蛋白頭部催化域中一個較短的α-螺旋末端的對面[25]。這些基團的氧化修飾，通常會導(dǎo)致肌球蛋白S1的構(gòu)象發(fā)生變化，影響了肌球蛋白S1和其底物的相互作用[26]。由圖3可知，各組MP樣品的Ca-ATP酶活性隨氧化時間的延長均顯著下降（P＜0.05）。未氧化MP的Ca-ATP酶活性為0.95 mmol/g，隨著氧化的進行顯著下降（P＜0.05），分別下降了40.35%（1 h）、58.63%（3 h）和81.22%（5 h）。CE和RE的添加顯著地抑制了Ca-ATP酶活性的損失（P＜0.05），氧化1、3、5 h后，與未氧化樣品相比較，添加1.0 mg/mL CE組中Ca-ATP酶活性分別下降了16.8%、19.0%和46.97%；添加1.0 mg/mL RE組分別下降了16.75%、23.56%和56.02%。而CME和LE的添加不但沒有抑制Ca-ATP酶活性的損失，相反在一定程度上加速了Ca-ATP酶活性的損失。這可能是由于CME和LE提取物中的化學(xué)成分與MP樣品中Ca-ATP酶活性部位的巰基相結(jié)合，改變了酶活性部位的結(jié)構(gòu)，從而影響了酶的活性。因此CE和RE較好地控制了Ca-ATP酶活性的氧化損失，而CME和LE無積極作用。

圖3 不同質(zhì)量濃度的4 種香辛料提取物對不同氧化時間MP Ca-ATP酶活性的影響Fig. 3 Effect of different concentrations of four spice extracts on MP Ca-ATPase activity at different time points of oxidation

2.3 4 種香辛料提取物對不同氧化時間MP表面疏水性的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度的4 種香辛料提取物對不同氧化時間MP表面疏水性的影響Fig. 4 Effect of different concentrations of four spice extracts on MP surface hydrophobicity at different time points of oxidation

蛋白質(zhì)的氧化會改變其天然的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，蛋白結(jié)構(gòu)的氧化展開，使得蛋白溶液中疏水性基團的比例明顯增加，從而增加了表面疏水性[27]。如圖4所示，所有MP樣品的表面疏水性均隨氧化時間的延長而顯著增加（P＜0.05）。4 種香辛料提取物都具有抑制表面疏水性增加的作用，且均隨提取物添加量的增加而增強。與未添加香辛料提取物樣品相比，氧化5 h時，添加0.1、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL CE組的表面疏水性分別下降了6.84%、26.32%、33.53%；添加RE組的表面疏水性分別下降了2.78%、4.83%、12.74%；添加CME組的表面疏水性分別下降了6.13%、8.05%、15.08%；添加LE組的表面疏水性分別下降了6.88%、12.74%、15.08%。表明CE控制表面疏水性增加的效果最好，在較低的質(zhì)量濃度（0.5 mg/mL）就能發(fā)揮很好的作用，顯著地抑制了表面疏水性的增加（P＜0.05）。4 種香辛料提取物，控制表面疏水性增加的效果為：CE＞LE＞CME≈RE。

2.4 4 種香辛料提取物對不同氧化時間MP巰基含量的影響

圖5 不同質(zhì)量濃度的4 種香辛料提取物對不同氧化時間MP巰基含量的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of four spice extracts on MP thiol group content at different time points of oxidation

巰基的損失通常被認為是二硫鍵形成的一個直接結(jié)果，也是一個很好描述肌肉中蛋白質(zhì)氧化的指標(biāo)[28]。如圖5所示，所有樣品的巰基含量均隨氧化時間的延長而顯著降低（P＜0.05），這說明氧化后的MP發(fā)生了二硫鍵的交聯(lián)，使巰基含量下降，未氧化MP的巰基含量為52.6 nmol/mg，氧化后添加4 種提取物樣品的巰基含量均顯著降低（P＜0.05），提取物添加量為1.0 mg/mL，氧化5 h時，CE組巰基含量為17.6 nmol/mg，RE組為24.2 nmol/mg，CME組為29.5 nmol/mg，LE組為26.5 nmol/mg。因此，對巰基下降的抑制效果為CME＞LE＞RE＞CE。然而，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)巰基的損失不完全是氧化導(dǎo)致的二硫鍵交聯(lián)所致，有一部分原因是由于巰基和多酚化合物發(fā)生作用，形成了巰基-醌加成物，從而也降低了巰基的含量[5,29-30]。Jongberg等[31]將富含多酚的白葡萄提取物添加到生牛肉餅中，采用高氧氣調(diào)包裝冷卻貯藏，也得到了與本實驗一致的結(jié)果。

2.5 4 種香辛料提取物對不同氧化時間MP溶解性的影響

如圖6所示，所有MP樣品的溶解性均隨氧化時間的延長而顯著下降（P＜0.05）。未氧化MP樣品的溶解度為74.06%，氧化1、3、5 h后分別下降到66.07%、54.67%和45.57%（P＜0.05）。氧化5 h時，添加0.1、0.5 mg/mL 和1.0 mg/mL CE組的溶解度分別為47.42%、50.92%和57.55%（P＜0.05），RE組的溶解度分別為47.15%、50.30%和54.00%（P＜0.05），LE組的溶解度分別為46.99%、47.50%和48.10%（P＜0.05），表明CE、RE和LE的添加顯著抑制了氧化導(dǎo)致的MP溶解性降低，且CE的效果最好。相反，CME的添加，加速了蛋白溶解性的下降，這可能是由于CME提取物成分與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而加速了蛋白質(zhì)的聚集，削弱了蛋白與水的相互作用。MP溶解性的下降主要是由于蛋白質(zhì)側(cè)鏈遭到自由基的氧化攻擊形成了大量的羰基，同時蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)伸展，使疏水基團外露，從而降低了蛋白質(zhì)的溶解性[5,8]。蛋白羰基和表面疏水性的結(jié)果表明，CE和RE顯著抑制這2 項指標(biāo)的增加，從而有效地控制了蛋白溶解性的下降，這與本部分的測定結(jié)果相一致。對蛋白溶解性下降的控制作用為CE＞RE＞LE，CME無積極作用。

圖6 不同質(zhì)量濃度的4 種香辛料提取物對不同氧化時間MP溶解性的影響Fig. 6 Effect of different concentrations of four spice extracts on MP solubility at different time points of oxidation

3 結(jié) 論

4 種香辛料提取物對豬肉MP的抗氧化能力存在較大的差異，CE、RE和CME的添加顯著抑制了蛋白羰基的形成（P＜0.05），對羰基含量的抑制能力為CE＞RE＞CME，LE的作用不顯著；CE和RE對Ca-ATP酶活性下降具有顯著的抑制作用（P＜0.05），CME和LE的無積極作用；4 種提取物控制表面疏水性增加的效果為CE＞LE＞CME≈RE；對蛋白溶解性下降的控制順序為CE＞RE＞LE，CME無積極作用；提取物的添加均不同程度地加速了蛋白巰基的下降，這主要是由于巰基和多酚化合物發(fā)生作用，形成了巰基-醌加成物。綜合以上抗氧化數(shù)據(jù)可以得出，CE和RE具有較好的抑制豬肉MP氧化的作用。今后還需進一步研究不同香辛料提取物與豬肉MP的作用機制，以及與巰基形成巰基-醌加成物的量化研究，從而明確多酚與蛋白的具體作用方式。