3 種方法提取的澳洲堅(jiān)果蛋白功能性質(zhì)與構(gòu)象的關(guān)系

陳 豪，鐘俊楨*，黃宗蘭，熊 洋，鐘業(yè)俊，劉成梅

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

澳洲堅(jiān)果（Macadamia integrifolia）屬山龍眼科，起源于澳大利亞?wèn)|部的熱帶雨林，在二十世紀(jì)六七十年代被引入中國(guó)，主要在我國(guó)南方地區(qū)種植。澳洲堅(jiān)果果仁因香脆可口、風(fēng)味獨(dú)特而被應(yīng)用于食品行業(yè)如糖果和烘焙等。堅(jiān)果仁中油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)70%以上，其中，澳洲堅(jiān)果中總脂肪酸的70%是單不飽和脂肪酸[1]。目前，在澳洲堅(jiān)果油的健康益處方面已經(jīng)有很多研究[2-4]，其他研究主要集中在干燥或烘烤過(guò)程中還原糖對(duì)褐變反應(yīng)的影響[5-7]。

近年來(lái)，一些植物果實(shí)（堅(jiān)果、腰果等）作為一種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、相對(duì)較低成本的優(yōu)質(zhì)蛋白來(lái)源吸引了研究者們廣泛的關(guān)注與興趣[8]。澳洲堅(jiān)果仁中含有大約9%的蛋白質(zhì)，富含18 種氨基酸，其中有10 種是必需氨基酸，人體無(wú)法自身合成。此外，澳洲堅(jiān)果也用作油脂提取的原料，并能得到低脂肪的果粕副產(chǎn)物[4]。提取油脂后的果粕中含有大量蛋白質(zhì)和平衡的氨基酸組分，是很好的植物蛋白資源。Siwaporn等[9]的研究表明，澳洲堅(jiān)果脫脂粉中含有約30%的蛋白質(zhì)?？蓱?yīng)用于食品工業(yè)的植物蛋白應(yīng)該具備一些理想的功能特性，如溶解性、乳化性、起泡性、凝膠性以及較好的持水持油性等[10-11]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已深入研究過(guò)一些植物蛋白，如大豆分離蛋白、大米蛋白、花生蛋白、豌豆分離蛋白以及菜籽分離蛋白等。然而，國(guó)內(nèi)外對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白的功能性質(zhì)的研究卻有限。為充分開(kāi)發(fā)和利用澳洲堅(jiān)果蛋白這種優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源，研究其功能特性尤為重要。

不同的植物蛋白提取方法得到的蛋白具有一定的理化以及功能特性差異。蛋白的提取方法主要有水相萃取法、有機(jī)溶劑浸提法、酶解法等?？紤]到本研究處于一個(gè)基礎(chǔ)研究階段以及其他方法如有機(jī)溶劑提取法中的有機(jī)試劑可能有毒、揮發(fā)性高、蛋白質(zhì)易變性等，本課題選取水相萃取法作為澳洲堅(jiān)果蛋白的提取方法。水相萃取法具有操作簡(jiǎn)單、方便易行以及萃取水相較安全等優(yōu)點(diǎn)。最常見(jiàn)的萃取相有稀酸、稀堿以及鹽溶液等，主要包括堿提酸沉法、Tris-HCl提取法以及氯化鈉提取法等。目前，對(duì)于不同植物蛋白的功能性質(zhì)，研究主要集中在不同提取條件對(duì)植物蛋白功能性質(zhì)的影響上。許多報(bào)告表明，蛋白質(zhì)提取的處理方法會(huì)影響蛋白質(zhì)的組成和功能。Ogunwolu等[12]研究了堿提-等電點(diǎn)沉淀與堿提-甲醇沉淀兩種方法提取得到的腰果濃縮蛋白和分離蛋白，并發(fā)現(xiàn)腰果蛋白的功能性質(zhì)（吸水吸油能力、乳化穩(wěn)定性、發(fā)泡性以及凝膠性）得到了改善，均高于脫脂腰果粉。Bora等[13]研究不同pH值對(duì)澳洲堅(jiān)果分離蛋白的提取率和功能性質(zhì)的影響，結(jié)果表明pH值對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白的功能性質(zhì)影響顯著。Karaca等[14]研究等電點(diǎn)沉淀法與鹽萃取法制備的油菜籽蛋白與亞麻仔蛋白的乳化性能，并探究其乳化性能與構(gòu)象之間的關(guān)系。在本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中，工作主要集中在腰果蛋白的提取工藝優(yōu)化、功能性質(zhì)研究以及其氨基酸組成分析上[15-16]。此外，Liu Chengmei等[17]研究表明蛋白的功能性質(zhì)與其構(gòu)象有顯著聯(lián)系。然而，不同提取方法下澳洲堅(jiān)果蛋白的功能性質(zhì)與其構(gòu)象以及兩者之間的關(guān)系的研究很少。

因此，基于本課題組前期的一些研究，本實(shí)驗(yàn)使用堿提取法、Tris-HCl提取法和氯化鈉提取法提取澳洲堅(jiān)果脫脂粉中的蛋白質(zhì)分別得到3 種不同的澳洲堅(jiān)果蛋白，并對(duì)其溶解性和乳化性進(jìn)行對(duì)比與研究。此外，本實(shí)驗(yàn)采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、粒度分布、內(nèi)源熒光光譜、表面疏水性、掃描電子顯微鏡、氨基酸分析對(duì)其構(gòu)象進(jìn)行表征和研究，以期闡明不同提取方法3 種澳洲堅(jiān)果蛋白的功能性質(zhì)和構(gòu)象之間的關(guān)系，為開(kāi)發(fā)和利用澳洲堅(jiān)果蛋白提供一些理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳洲堅(jiān)果 江西南昌洪城大市場(chǎng)。在4 ℃保存直至使用。原料及分離蛋白的蛋白含量用微量凱氏定氮儀測(cè)定（N×5.3）并得到原料蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.2%。

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、8-苯胺基-1-萘磺酸鈉、三（羥甲基）氨基甲烷（tris (hydroxymethyl) aminomethane，Tris-HCl） 索萊寶生物科技有限公司；石油醚、苯酚、溴酚藍(lán) 廣東汕頭西隴科技股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

微量凱式定氮儀 丹麥Kjeltec公司；UV-1600PC紫外分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；Nicomp 380/ZLS Zeta potential/粒度儀 美國(guó)Nicomp公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；氨基酸分析儀 德國(guó)Sykam公司；掃描電子顯微鏡 德國(guó)Deutschland GmbH公司；LGJ-1-A80冷凍干燥機(jī) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；DFY-50磨粉機(jī) 中國(guó)戴德公司。

1.3 方法

1.3.1 澳洲堅(jiān)果脫脂粉的制備

將手工剝殼后的澳洲堅(jiān)果仁用磨粉機(jī)碾磨30 s，然后用料液比1∶10（g/mL）的石油醚浸提，在室溫連續(xù)攪拌22 h，然后通過(guò)抽濾將原料和溶劑分離，分離得到的粗脫脂粉再次用石油醚浸提，然后重復(fù)上述步驟，脫脂粉中的殘留溶劑在通風(fēng)櫥中于室溫下?lián)]發(fā)1 h除去，得到的澳洲堅(jiān)果脫脂粉經(jīng)真空包裝后于－4 ℃貯存。

1.3.2 從澳洲堅(jiān)果脫脂粉中提取分離蛋白

1.3.2.1 堿提酸沉澳洲堅(jiān)果蛋白（alkali extraction and acid precipitation extracted macademia protein isolate，MAPI）

澳洲堅(jiān)果脫脂粉與去離子水以1∶50（g/mL）混合，并用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0。樣品在45 ℃攪拌2 h，然后在室溫下以4 000 r/min離心15 min，收集上清液并用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至4.5使蛋白沉淀，以4 000 r/min離心15 min，收集沉淀蛋白，然后回收并再分散到去離子水中，最后，調(diào)節(jié)分散液pH值至7.0并凍干。

1.3.2.2 三（羥甲基）氨基甲烷提取澳洲堅(jiān)果蛋白（tris (hydroxymethyl) aminomethane extracted macademia protein isolate，MTPI）

澳洲堅(jiān)果脫脂粉與0.2 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）以1∶50（g/mL）的比例混合，樣品在45 ℃攪拌2 h，然后在室溫以4 000 r/min離心15 min，然后用傳統(tǒng)的MAPI法從獲得的上清液中沉淀出蛋白并凍干。

1.3.2.3 氯化鈉提取澳洲堅(jiān)果蛋白（sodium chloride extracted macadamia protein isolate，MSPI）

澳洲堅(jiān)果脫脂粉與0.14 mol/L NaCl溶液以1∶50（g/mL）的比例混合，樣品在45 ℃攪拌4 h，然后在室溫下以4 000 r/min離心15 min，收集上清液并用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至4.5使蛋白沉淀，以4 000 r/min離心15 min，收集沉淀蛋白，然后再分散到去離子水中，在蒸餾水中透析24 h并凍干。

1.3.3 蛋白質(zhì)溶解度測(cè)定

溶解在去離子水中的蛋白質(zhì)分散體（0.1 g/100 mL）經(jīng)磁力攪拌30 min，然后用0.5 mol/L HCl溶液或0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0、3.5、5.0、6.5、8.0、9.5、11.0，磁力攪拌30 min后，在4 000 r/min離心15 min。經(jīng)適當(dāng)稀釋后，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，采用Bradford[18]法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)溶解度為每100克蛋白質(zhì)中可溶性蛋白質(zhì)的克數(shù)。所有測(cè)定做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 乳化特性測(cè)定

根據(jù)Zhao Guanli等[19]的方法稍作修改后測(cè)定乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）。將5 mL色拉油和15 mL溶于去離子水中的樣品溶液（0.1 g/100 mL）混合，混合液用均質(zhì)機(jī)以9 500 r/min的轉(zhuǎn)速均質(zhì)1 min制成乳狀液。均質(zhì)后立即用移液槍從容器底部吸取乳狀液50 μL，并與5 mL 0.1 g/100 mL的SDS溶液混合，在旋渦混合器中搖晃5 s，然后用UV1600紫外分光光度計(jì)在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。EAI值公式計(jì)算如下：

式中：DF為稀釋因子（100）；C為初始蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；?為光程（1 cm）；θ為形成乳液的油的體積分?jǐn)?shù)（0.25）；A0為在0 min時(shí)稀釋后乳化液的吸光度。

1.3.5 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)是根據(jù)Laemmli[20]的方法用12%分離膠和5%濃縮膠在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行的。在0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中的蛋白樣品溶液（1 mg/mL）與4×樣品緩沖液（含0.2 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)8% SDS、體積分?jǐn)?shù)4% β-巰基乙醇、體積分?jǐn)?shù)40%甘油和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%溴酚藍(lán)）以1∶3體積比混合，然后混合液在沸水中加熱5 min，接著以10 000 r/min離心10 min，每個(gè)樣品取8 μL上清液加入各加樣孔中，同時(shí)加入低分子質(zhì)量Marker（14.4～106 kDa）作為參比。在濃縮膠和分離膠中分別以8 mA和15 mA的恒流電泳，當(dāng)染料到達(dá)分離膠底部時(shí)停止電泳。電泳結(jié)束后凝膠用溶于乙酸-甲醇-水（46∶227∶227，V/V）溶液中的考馬斯亮藍(lán)R-250（0.05%）染色1 h，然后用甲醇-乙酸-水（50∶75∶875，V/V）溶液脫色12 h。

1.3.6 氨基酸分析

根據(jù)Sze-Tao等[21]方法蛋白樣品用6 mol/L含10 mmol/L 苯酚的HCl溶液用氨基酸分析儀在110 ℃真空條件下水解24 h。

1.3.7 粒度分布測(cè)定

根據(jù)Liu Chengmei等[17]的方法，樣品在樣品分散裝置中邊攪拌邊加入去離子水稀釋100 倍，粒度分布用Nicomp 380/ZLS Zeta potential/粒度儀測(cè)定?；趧?dòng)態(tài)光散射的Nicomp 380測(cè)得的粒度和粒度分布能精確到1 nm。

1.3.8 內(nèi)源熒光測(cè)定

根據(jù)Liu Yan等[22]的方法修改后用熒光光度計(jì)測(cè)定蛋白樣品的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜。凍干的MAPI、MTPI和MSPI樣品溶解在磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.0）中得到蛋白溶液（1 mg/mL），在20 ℃處理1 h，然后混合液在4 000 r/min 離心15 min，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量。將得到的上清液稀釋至0.2 mg/mL，為了盡量減少酪氨酸殘基對(duì)發(fā)射光譜的影響，蛋白質(zhì)溶液的激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～380 nm，狹縫寬度為5.0 nm。

1.3.9 表面疏水性測(cè)定

根據(jù)Kato等[23]的方法用8-苯胺基-1-萘磺酸鈉（sodium 8-anilino-1-naphthalenesulfonate，ANS）作為熒光探針測(cè)定樣品的H0值。凍干的MAPI、MTPI和MSPI樣品溶解在PBS（0.01 mol/L，pH 7.0）中制成蛋白溶液（1 mg/mL），在20 ℃處理1 h，然后混合液在4 000 r/min離心15 min，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量。將得到的上清液用相同緩沖液將質(zhì)量濃度依次稀釋至0.5～0.02 mg/mL，然后將20 μL ANS（8.0 mmol/L于相同緩沖液中）加入4 mL蛋白樣品中，用熒光光度計(jì)在室溫測(cè)定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為338 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為400～600 nm。用線性回歸分析計(jì)算得到的熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度的初始斜率表示表面疏水性H0。

1.3.10 掃描電子顯微鏡觀察

根據(jù)Liu Chengmei等[17]的方法稍作修改，凍干的MAPI、MTPI和MSPI用雙面膠固定在圓形樣品臺(tái)上，然后用掃描電子顯微鏡觀察樣品。掃描電子顯微鏡在低真空模式下工作。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 ±s表示，最小顯著差異用IBM SPSS Statistics 19.0檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白溶解度

圖1顯示了pH值對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白（MAPI、MTPI和MSPI）溶解度的影響，在pH 2.0～11.0的范圍內(nèi)所有樣品都表現(xiàn)出了相似的U型曲線的趨勢(shì)，這和其他堅(jiān)果蛋白如腰果脫脂蛋白、胡桃木蛋白、巴西果蛋白類似。根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度曲線，MAPI在pH 5.0時(shí)溶解度最低（0.89±0.26）%，而MTPI（4.61±2.82）%和MSPI（2.60±1.92）%在pH 6.5時(shí)溶解度最低。根據(jù)Swanson[24]的研究報(bào)道，豌豆和扁豆球蛋白的等電點(diǎn)為pH 4.5，其清蛋白的等電點(diǎn)為pH 6.0。Papalamprou等[25]報(bào)道稱等電沉淀主要沉淀球蛋白。此外，Liu等[26]發(fā)現(xiàn)用鹽提取法提取的產(chǎn)物主要為球蛋白和清蛋白的混合物。因此，MAPI可能主要為球蛋白，而MTPI和MSPI可能主要為球蛋白和清蛋白的混合物，這可能導(dǎo)致MAPI與MTPI和MSPI有不同的等電點(diǎn)。

圖1 pH值對(duì)MAPI、MTPI和MSPI溶解度的影響Fig. 1 Effect of pH on solubility of MAPI, MTPI and MSPI

從圖1可以看出，澳洲堅(jiān)果蛋白在酸性（pH 2.0、3.5）和堿性（pH 11.0）pH值范圍內(nèi)溶解度較高（＞80%），然而在pH 5.0～9.5范圍內(nèi)溶解度低于30%。此外，在酸性pH值范圍內(nèi)MSPI的溶解度高于MAPI和MTPI。然而，在堿性pH值范圍內(nèi)，MSPI的溶解度低于MAPI和MTPI。Aluko等[27]表明酸沉淀分離的油菜籽分離蛋白在pH 7.0時(shí)的溶解度較低（＜6%），而鈣沉淀分離（1 mol/L CaCl2）的分離蛋白溶解度較高（約78.8%）。Yoshie-Stark等[28]表明用等電沉淀法得到的菜籽分離蛋白在pH 7.0的溶解度（約25%）明顯低于用超濾法得到的分離蛋白（約90%）。綜上所述，不同的提取方法會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解度，這可能是由于不同的提取方法會(huì)造成蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)不同。

2.2 乳化性質(zhì)

食物蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)一般可以通過(guò)EAI評(píng)定[29]。如表1所示，3 種方法提取得到的蛋白質(zhì)的EAI具顯著性差異（P＜0.05），在中性pH值（6.5～7.5）條件下，MSPI的EAI（（246.88±34.23） m2/g）高于MAPI（（193.25±9.93）m2/g）和MTPI（（84.34±12.30）m2/g）。這一結(jié)果與Karaca等[14]的研究一致，其研究表明鹽提取法制備的油菜籽分離蛋白的EAI高于等電沉淀法制備的蛋白質(zhì)。Krause等[30]也報(bào)道稱NaCl提取的亞麻籽分離蛋白的EAI明顯高于等電點(diǎn)沉淀蛋白。EAI還受蛋白質(zhì)溶解度或表面疏水性的影響[31]。此外，根據(jù)Liu Chengmei等[17]研究表明蛋白質(zhì)的乳化性與其粒徑大小呈正比，粒徑越小，乳化性更低。由后面的粒徑分析可知，MTPI比MAPI具有更小的粒徑。綜上可得，蛋白的乳化性受提取方法，溶解度，表面疏水性以及粒徑等多方面因素的影響。由三者EAI的差異可得，提取方法可能是影響EAI的主要因素。盡管MTPI的蛋白含量比MAPI和MSPI低，在pH 6.5～7.5的范圍，3 種蛋白樣品的溶解度越高，其EAI反而越低。原因可能還是不同的蛋白提取方法造成蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)不同。

表1 MAPI、MTPI和MSPI的蛋白質(zhì)含量、乳化性能、H0值和得率Table 1 Protein content, emulsifying properties, H0 values and protein yields of MAPI, MTPI and MSPI

2.3 蛋白得率、蛋白質(zhì)含量與SDS-PAGE分析

由表1可知，MAPI、MTPI和MSPI的蛋白質(zhì)得率分別為12.5%、6.3%和7.6%，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（88.93±0.09）%、（80.28±0.050）%和（86±0.11）%。堿提酸沉的蛋白得率和蛋白純度均高于Tris-HCl提取法和氯化鈉提取法，并且蛋白得率越高，蛋白含量也越高。李瑩瑩等[32]報(bào)道了Tris-HCl提取法、鹽溶法、磷酸緩沖液提取法以及TCA-丙酮提取法得到的4 種白果蛋白，并且Tris-HCl提取法獲得的白果蛋白含量最高。Karaca等[14]研究表明各種植物蛋白得率在20%～29%之間。為進(jìn)一步探究這3 種蛋白質(zhì)的組成，用SDS-PAGE研究3 種分離蛋白的多肽條帶，如圖2所示。對(duì)于3 種提取方法，在還原條件下主要有4 個(gè)條帶（a1～a4），其他次要條帶也能從圖中觀察到。不同提取方法得到的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布在14.4～50 kDa狹窄范圍內(nèi)?？傊?，澳洲堅(jiān)果蛋白大部分是低分子質(zhì)量蛋白，這與其他堅(jiān)果蛋白如榛子蛋白[31]、白木通籽蛋白[32]很相似。

圖2 澳洲堅(jiān)果蛋白原料、MSPI、MTPI和MAPI在還原條件下的電泳圖Fig. 2 Reducing SDS-PAGE profiles of macadamia nut,MSPI, MTPI, and MAPI

如圖2所示，澳洲堅(jiān)果原料（泳道1）的條帶最多，而在泳道2、3、4中a4（14.4～18.4 kDa）條帶缺失，這一結(jié)果表明，蛋白質(zhì)的提取過(guò)程造成了a4條帶的損失或者a4條帶不能成功地從澳洲堅(jiān)果原料中提取出來(lái)。

總之，蛋白提取物具有相似的蛋白條帶（泳道2、3、4），但條帶寬度和強(qiáng)度不同。在澳洲堅(jiān)果分離蛋白中明顯觀察到3個(gè)主要的亞基條帶，即a1（45.0～50.0 kDa），a2（35.0～45.0 kDa），a3（2 3 k D a）。M S P I（泳道2）中亞基條帶a1（45.0～50.0 kDa）的強(qiáng)度明顯比MTPI（泳道3）和MAPI（泳道4）淺，這可能是因?yàn)椴煌崛l件下得到的不同條帶的蛋白質(zhì)濃度不同，可能與分離蛋白的功能特性的差異性有密切關(guān)系。

2.4 氨基酸分析結(jié)果

MAPI、MTPI和MSPI的氨基酸組成見(jiàn)表2。MSPI的總氨基酸含量（92.78%）高于MTPI （87.07%）和MAPI（83.15%）。此外，在MAPI、MTPI和MSPI中，含量最豐富的是谷氨酸（15.70%～19.74%）和精氨酸（13.29%～14.16%）（表2），這與苦瓜籽分離蛋白的結(jié)果相似[33]。對(duì)于必需氨基酸，MTPI的總必需氨基酸含量（38.79%）高于MAPI（37.21%）和MSPI（35.43%）。3 種分離蛋白的氨基酸組成相似，但氨基酸含量不同。MSPI的苯丙氨酸和賴氨酸含量低于MAPI和MTPI，但其谷氨酸和甘氨酸含量相對(duì)較高。蛋白質(zhì)氨基酸含量的不同可能使MTPI、MAPI和MSPI的功能特性存在差異。

表2 澳洲堅(jiān)果分離蛋白MAPI、MTPI和MSPI的氨基酸含量組成Table 2 Amino acid compositions of MAPI, MTPI and MSPI%

2.5 表面疏水性與內(nèi)源熒光發(fā)射光譜測(cè)定

3 種提取方法得到的澳洲堅(jiān)果分離蛋白的H0值見(jiàn)表1。MSPI的H0值（730.86）高于MTPI（409.06）和MAPI（292.31），這與Karaca等[14]的研究結(jié)果類似，其研究表明鹽提取法得到的亞麻籽分離蛋白的H0值高于等電沉淀法，然而，油菜籽分離蛋白的結(jié)果卻相反。澳洲堅(jiān)果分離蛋白的H0值高于油菜籽分離蛋白、亞麻籽分離蛋白[14]、鷹嘴豆分離蛋白、蠶豆分離蛋白、扁豆分離蛋白和豌豆分離蛋白（55.2～84.8）[34]。

圖3 澳洲堅(jiān)果分離蛋白內(nèi)源熒光發(fā)射光譜Fig. 3 Intrinsic emission fl uorescence spectra of macadamia protein isolates

從圖3可以看出，熒光發(fā)射峰的波長(zhǎng)沒(méi)有隨提取方法的不同而發(fā)生移動(dòng)，但MSPI的熒光強(qiáng)度明顯高于MAPI和MTPI，且MAPI和MTPI的熒光強(qiáng)度相近。這一結(jié)果與H0值一致（表1）。在本研究中，與MTPI和MAPI相比，MSPI較高的H0值和熒光強(qiáng)度可以通過(guò)其相對(duì)較高的EAI和較低的溶解度來(lái)解釋。

2.6 粒度分布和掃描電子顯微鏡分析

圖4 澳洲堅(jiān)果分離蛋白的平均粒徑Fig. 4 Mean particle size distribution of macadamia protein isolates

從圖4可以看出，MTPI（曲線2）的粒度分布更集中且分布寬度更窄。MTPI的平均粒徑為245.3 nm，粒徑范圍為50 nm～1 μm。MSPI（曲線3）的平均粒徑為273.7 nm。MAPI（曲線1）的分布寬度最寬，為30 nm～2 μm，其平均粒徑為381.4 nm。

圖5 澳洲堅(jiān)果分離蛋白MAPI、MTPI、MSPI的掃描電子顯微鏡圖（×16 000）Fig. 5 SEM profiles of MAPI, MTPI and MSPI ( × 16 000)

MAPI（圖5A）呈均勻雪花狀顆粒，而MTPI（圖5B）表現(xiàn)為較大的不均勻塊狀顆粒。很明顯，MSPI（圖5C）的特性差異顯著，表現(xiàn)為含有不同大小的球狀結(jié)構(gòu)的不均勻顆粒。Siwaporn等[9]已經(jīng)研究了澳洲堅(jiān)果脫脂粉的微觀形貌，結(jié)果表明蛋白質(zhì)和淀粉顆粒嵌入在澳洲堅(jiān)果脫脂粉內(nèi)核組織中，且淀粉顆粒呈橢圓形，直徑約10 μm。在圖5中，最大球狀結(jié)構(gòu)直徑小于5 μm，這表明MSPI含有球狀蛋白。同時(shí)，由圖4和圖5可以看出，MTPI的顆粒尺寸小于MSPI和MAPI。根據(jù)Bouaouina等[35]的研究，粒徑不同會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能特性。此外，三者的微觀形貌與內(nèi)源熒光相一致，可能MSPI更多的球狀結(jié)構(gòu)以及不均勻顆粒使色氨酸更多暴露在環(huán)境中。

3 結(jié) 論

本研究主要集中在澳洲堅(jiān)果蛋白的功能特性和構(gòu)象之間的關(guān)系研究。氯化鈉提取得到的MSPI具有與堿提取得到的MAPI和Tris-HCl提取得到的MTPI不同的功能特性。澳洲堅(jiān)果分離蛋白在酸性pH值范圍（pH 2.0～3.5）和在堿性pH值范圍（pH 11）內(nèi)都具有較高的溶解度（＞80%），而在pH 5.0～9.5其溶解度低于30%。與MAPI和MTPI相比，MSPI的溶解度在酸性PH值范圍內(nèi)最高，而在堿性pH值范圍內(nèi)最低。此外，MSPI的EAI（（246.88±34.23）m2/g）高于MAPI和MTPI。MAPI、MTPI和MSPI的蛋白含量分別為88.9%、80.3%和86.1%。澳洲堅(jiān)果分離蛋白亞基的分子質(zhì)量主要在14.4～50.0 kDa之間。SDS-PAGE和氨基酸分析結(jié)果表明3 種分離蛋白具有相似的蛋白條帶和氨基酸組成，但它們的條帶強(qiáng)度和氨基酸數(shù)量不同。此外，與MAPI和MTPI相比，MSPI具有較高的表面疏水性和熒光強(qiáng)度以及較小的粒度。掃描電子顯微鏡結(jié)果表明，MSPI比MAPI和MTPI具有更多的由不同大小的球狀結(jié)構(gòu)組成的不均勻顆粒。3 種提取方法引起的蛋白質(zhì)構(gòu)象的差異可能會(huì)造成它們功能特性的不同。