硫唑嘌呤預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制的研究

于保旭 李鐵成

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院,錦州121000)

隨著心臟介入手術(shù)的廣泛開(kāi)展，在治療以急性心梗為代表的心血管疾病上取得了巨大進(jìn)步，然而，再灌注損傷帶來(lái)的弊端也讓我們臨床工作者不容忽視[1]。硫唑嘌呤(Azathioprine,AZA)是臨床上常用的免疫抑制劑，其作用機(jī)制主要體現(xiàn)在阻礙嘌呤核苷生成。但是AZA在心肌缺血再灌注損傷是否也具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用具體體現(xiàn)在哪一種機(jī)制上到目前為止尚無(wú)確切定論[2]。本研究以心肌缺血再灌注損傷為切入點(diǎn)，研究硫唑嘌呤預(yù)處理對(duì)MIRI大鼠模型的保護(hù)作用，探討硫唑嘌呤在心肌缺血再灌注損傷中的分子機(jī)制和其與TLR4信號(hào)通路之間的內(nèi)在聯(lián)系，為硫唑嘌呤的臨床療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠30只，12周齡、雄性、體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2主要試劑 硫唑嘌呤(C9H7N7O2S，分子量277.27)購(gòu)自上海意杰生物科技有限公司；MDA、SOD、MPO、TNF-α和IL-6試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TLR4抗體及鼠單克隆抗β-actin購(gòu)自武漢博士德公司；其他試劑由錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立 SD大鼠用3%戊巴比妥鈉以50 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，固定四肢后安裝心電監(jiān)護(hù)儀，氣管插管并連接動(dòng)物呼吸機(jī)(潮氣量為1.5 ml/100 g，頻率60次/min)，用針型電極記錄大鼠心電圖。之后切開(kāi)大鼠皮膚：以胸骨中線為基準(zhǔn)，起于胸鎖關(guān)節(jié)平線止于劍突上方。鈍性分離肌群，剪斷胸骨左緣處第2～4根肋骨，開(kāi)胸器撐開(kāi)，將心包剪開(kāi)暴露心臟。分離左冠狀動(dòng)脈前降支，用2/0-T號(hào)線在冠脈左前降支1～2 mm處穿線結(jié)扎[3]。各組(假手術(shù)組除外)用一凹形乳膠管墊在血管與結(jié)扎線之間，自心肌缺血在心電圖中顯示開(kāi)始，30 min 后將結(jié)扎線順著凹形乳膠管剪掉，使心肌血流恢復(fù)，隨后保持120 min再灌注。結(jié)扎冠狀脈期間，以心電圖改變確定缺血再灌注造模成功[4]：冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎，ST段明顯抬高；再灌注時(shí)，ST段抬高后回落，回落幅度不低于50%。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 將SD大鼠隨機(jī)分為模型組、硫唑嘌呤組和假手術(shù)組，每組10只。模型組(Model)：結(jié)扎30 min以上，保持120 min再灌注，且冠脈下穿線。硫唑嘌呤組(AzA)：硫唑嘌呤以3 mg/kg 劑量于手術(shù)前5 d每天灌胃給藥，5 d后的處理同模型組。假手術(shù)組(Sham)：保持不結(jié)扎狀態(tài)，且穿線位置設(shè)定為冠狀動(dòng)脈左前降支1～2 mm 處。

1.2.3標(biāo)本采集 造模完畢，大鼠麻醉并消毒后快速于頸總動(dòng)脈處取血并摘除心臟。血液以3 000 r/min 離心10 min取上清于EP管中。

1.2.4實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)

1.2.4.1心肌梗死面積測(cè)定 取心臟后，將右心室心肌和心房去除，預(yù)冷PBS清洗，-20℃ 20 min后取出心臟，按管狀結(jié)扎線下方與冠狀溝平行的方向?qū)⑿氖仪谐珊穸认嗟鹊?片，置于0.5%NBT溶液中，在37℃水浴中染色，PBS清洗，拍攝并分析。梗死區(qū)面積(%)=梗死區(qū)面積/全部心臟面積[5]。

1.2.4.2電鏡下心肌細(xì)胞超微觀察 標(biāo)本送至錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室由科研老師幫助完成。

1.2.4.3血液檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中CK-MB、cTnⅠ含量；試劑盒檢測(cè)SOD、MPO活力及MDA、TNF-α、IL-6水平。操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4.4Western blot方法檢測(cè)心肌組織TLR4蛋白表達(dá) 心肌組織剪碎后，加入裂解液再用超聲波粉碎，4℃ 10 000 r/min離心20 min，取上清進(jìn)行BSA定量。上清液100℃ 10 min蛋白變性，配制分離膠(12%)和濃縮膠(5%)。加樣15 μl，電壓調(diào)至80 V，電泳20 min，條帶剛跑過(guò)分離膠時(shí)調(diào)電壓至110 V，待所檢測(cè)條帶跑至適合的位置(根據(jù)marker判斷)停止電泳。120 mA恒流120 min轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉，室溫1 h，搖床。加1∶500 TLR4/1∶500 β-actin一抗稀釋液后，用自封袋壓膜，封好后4℃搖床過(guò)夜。加1∶5 000羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光，8 bit存圖。Image J軟件分析。

1.2.4.5免疫組化法對(duì)TLR4定位 石蠟常規(guī)脫蠟透明；組織抗原修復(fù)：放入抗原修復(fù)儀中，內(nèi)含檸檬酸Ag修復(fù)液，94℃ 20 min，PBS沖洗 5 min/次×3次；3%H2O2室溫10 min，PBS沖洗5 min/次×3次；羊血清工作液室溫1 h；滴加一抗TLR4(1∶200)，4℃過(guò)夜；PBS沖洗5 min/次×3次；滴加PV9001二抗試劑(1)/(2)，37℃ 20 min，PBS沖洗5 min/次×3次；DAB顯色液約5～10 min，ddH2O洗滌5 min/次×3次；蘇木素復(fù)染5～7 min，流水沖洗 5 min，根據(jù)染色情況進(jìn)行1%鹽酸酒精分化；酒精二甲苯透明后封片。Ipwin32軟件分析。

2 結(jié)果

2.1大鼠心肌梗死面積的測(cè)定 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死面積顯著增大(P<0.01)；與模型組比較，硫唑嘌呤組大鼠心肌梗死面積呈降低趨勢(shì)(P<0.01)。由此可見(jiàn)，在缺血再灌注條件下，經(jīng)硫唑嘌呤預(yù)處理，心肌遭受破壞的狀況明顯改善。見(jiàn)圖1、表1。

2.2心肌組織電鏡下改變 假手術(shù)組心肌間質(zhì)正常，細(xì)胞各結(jié)構(gòu)無(wú)水腫，電子分布較深且均勻，心肌纖維呈有序排列。模型組心肌細(xì)胞膜表面有致密電子陰影，細(xì)胞水腫嚴(yán)重，部分細(xì)胞器崩解，且心肌纖維呈無(wú)序斷裂狀。相較于模型組，硫唑嘌呤組心肌細(xì)胞水腫壞死狀況有所改善，細(xì)胞膜表面可見(jiàn)少量電子陰影，心肌纖維基本正常。見(jiàn)圖2。

圖1 三組大鼠心肌梗死面積Fig.1 Myocardial infarct size in three groups of rats

2.3血清CK-MB和cTnⅠ含量 與假手術(shù)組比較，模型組SD大鼠血清CM-MB及cTnⅠ水平呈增高趨勢(shì)(P<0.01)；與模型組比較，硫唑嘌呤組大鼠血清CK-MB及cTnⅠ水平呈降低趨勢(shì)(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.4SOD活性和MDA含量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清SOD含量均降低且MDA水平上升(P<0.01)；與模型組比較，硫唑嘌呤組大鼠SOD水平升高而MDA降低(P<0.01)。見(jiàn)表3。

GroupsDosage(mg/kg)Infarctsize(%)Sham group-0.36±0.04Model group-32.98±4.681)AZA group3 15.13±2.142)

Note：1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01 vs model group.

圖2 電鏡下心肌超微結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Ultrastructure changes of myocardium by electr-on microscopy

GroupsDosage(mg/kg)CK-MB(ng/ml)cTnⅠ(ng/ml)Sham group-27.41±3.703.62±0.51Model group-86.35±7.901)11.46±0.911)AZA group345.33±6.802) 5.52±0.742)

Note：1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01 vs model group.

GroupsDosage(mg/kg)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)Sham group-178.63±22.202.21±0.32Model group-131.32±17.301)3.54±0.421)AZA group3162.37±16.802) 2.80±0.292)

Note：1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01 vs model group.

2.5大鼠MPO含量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清MPO水平顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，硫唑嘌呤組大鼠MPO水平有一定程度的下調(diào)(P<0.01)。由此可知，硫唑嘌呤預(yù)處理方式可減輕由心肌缺血所致的心肌組織破壞程度。見(jiàn)表4。

2.6TNF-α和IL-6含量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α和IL-6水平均上升(P<0.01)；與模型組比較，硫唑嘌呤組大鼠TNF-α和IL-6水平呈降低趨勢(shì)(P<0.01)。見(jiàn)表5。

GroupsDosage(mg/kg)MPO(U/g protein)Sham group-5.83±0.75Model group-15.50±1.331)AZA group3 9.31±0.852)

Note：1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01 vs model group.

GroupsDosage(mg/kg)TNF-α(ng/L)IL-6(ng/L)Sham group-26.20±3.6170.20±8.47Model group-92.82±13.551)211.81±26.741)AZA group350.30±6.922) 139.62±23.762)

Note：1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01 vs model group.

圖3 心肌組織TLR4定位Fig.3 Location of TLR4 in myocardial tissue

圖4 心肌組織TLR4蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of TLR4 in myocardial tissue

2.7大鼠心肌組織TLR4蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TLR4蛋白顯著增高上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，硫唑嘌呤組大鼠TLR4蛋白呈降低趨勢(shì)(P<0.01)。見(jiàn)圖3、4。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制具有一定的復(fù)雜性，其病理生理因素涉及氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多個(gè)環(huán)節(jié)[5]。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，直接反映機(jī)體氧化應(yīng)激程度，并間接體現(xiàn)氧自由基對(duì)組織的損傷水平。超氧化物酶(SOD)作為氧自由基清除酶，能夠清除氧自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化物，緩解氧自由基誘導(dǎo)的組織損傷，并在一定程度上修復(fù)受損組織細(xì)胞[6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的主要環(huán)節(jié)，TLR4/NF-κBp65通路是細(xì)胞間信息交流的主要路徑，此通路活化能促進(jìn)炎癥因子生成，加快缺血再灌注損傷的發(fā)展進(jìn)程[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，硫唑嘌呤預(yù)處理能顯著降低血清中CK-MB、cTnⅠ活性及減小心肌梗死灶面積。由此可見(jiàn)，硫唑嘌呤能抑制心肌損傷所致的生物膜系統(tǒng)損傷，減少收縮蛋白cTnⅠ及肌細(xì)胞特有酶CK-MB從損傷的心肌內(nèi)部進(jìn)入到血液中，客觀證實(shí)了硫唑嘌呤能有效改善心肌損傷情況。電鏡結(jié)果顯示模型組心肌纖維斷裂，分列紊亂，細(xì)胞腫脹壞死，嚴(yán)重者局灶性壞死，并有炎性細(xì)胞侵潤(rùn)。硫唑嘌呤可使肌纖維排列趨于正常，降低炎性細(xì)胞侵潤(rùn)程度，減輕細(xì)胞腫脹和壞死，提示硫唑嘌呤預(yù)處理可改善缺血再灌注損傷的心肌形態(tài)，對(duì)MIRI大鼠的心肌具有保護(hù)作用。

有研究表明心肌缺血再灌注損傷打破機(jī)體原有的氧自由基生成和清除的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體血流供應(yīng)恢復(fù)之后氧自由基大幅度生成導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)急、慢性損傷[8,9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷導(dǎo)致機(jī)體自由基水平升高同時(shí)清除能力下降，而硫唑嘌呤處理降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平，上調(diào)抗氧化物SOD活性，改善氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)機(jī)體氧化-抗氧化平衡。同時(shí)硫唑嘌呤預(yù)處理使MPO含量下降，即氧化損傷明顯減輕，也說(shuō)明了硫唑嘌呤可能通過(guò)減輕氧化應(yīng)激，進(jìn)而緩解心肌缺血再灌注損傷。

近年大量研究證實(shí)TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是造成心肌缺血再灌注損傷的一項(xiàng)重要的信號(hào)途徑，其與氧自由基的形成有十分密切的聯(lián)系，同時(shí)還能夠激活中性粒細(xì)胞，加強(qiáng)缺血區(qū)域的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度[10,11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硫唑嘌呤預(yù)處理可以明顯降低由缺血再灌注導(dǎo)致的TLR4蛋白表達(dá)增加及細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6水平，進(jìn)一步說(shuō)明硫唑嘌呤預(yù)處理對(duì)缺血再灌注心肌炎癥反應(yīng)有抑制作用。Chong等[12]研究采用野生型(C3H/HeN)小鼠和TLR4基因缺陷小鼠(C3H/Hej)建立心肌缺血再灌注損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C3H/Hej小鼠的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度低于C3H/HeN小鼠，同時(shí)心肌梗死灶面積也減少40%。Oyama等[13]采用相同的動(dòng)物建立心肌缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)基因缺陷性小鼠心肌缺血梗死灶面積、補(bǔ)體沉積以及脂質(zhì)過(guò)氧化水平、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平均明顯低于野生型小鼠。由此可見(jiàn)，TLR4參與心肌缺血再灌注損傷時(shí)中性粒細(xì)胞的聚集效應(yīng)，促進(jìn)缺血缺氧區(qū)域的炎癥反應(yīng)，激活下游細(xì)胞因子發(fā)揮損傷效應(yīng)。而硫唑嘌呤預(yù)處理可以明顯抑制缺血再灌注激活的TLR4通路，下調(diào)下游炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6表達(dá)，改善缺血再灌注引起的心肌炎癥反應(yīng)，從而降低再灌注損傷。

綜上所述，硫唑嘌呤預(yù)處理通過(guò)下調(diào)TLR4信號(hào)通路，抑制心肌缺血再灌注導(dǎo)致的過(guò)度氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)氧化-抗氧化平衡，在一定程度上緩解缺血再灌注引起的心肌損傷進(jìn)程，為心肌缺血再灌注損傷的臨床治療提供新思路。