豬瘟的診斷方案及解決措施

劉照虎，曹 龍，馬梓承，王宏宇，孟凡亮，劉思當(dāng)，李寶全

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院臨床病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018）

1 診斷

1.1 發(fā)病背景

該豬場(chǎng)為1 000頭不同階段育肥豬豬場(chǎng)，在4月初相鄰的30日齡左右的育肥豬舍出現(xiàn)過(guò)豬瘟疫情的散發(fā)，采用豬瘟疫苗緊急免疫和藥物控制等措施兩周內(nèi)止住了疫情。從4月中下旬開(kāi)始在50至70日齡的育肥豬舍出現(xiàn)了疫情，發(fā)病率和死亡率超過(guò)50%。發(fā)病情況：50日齡病豬病程7 d左右，病豬耳尖及肢體末端的皮膚有大面積的出血，氣喘呼吸困難，食欲減退消瘦腹瀉，藥物控制沒(méi)有明顯效果。豬場(chǎng)疫苗注射情況：2日齡豬偽狂犬病疫苗滴鼻，豬圓環(huán)疫苗14日齡首免，豬藍(lán)耳病疫苗21日齡首免，豬瘟疫苗28日齡首免，35日齡免疫口蹄疫疫苗，在60日齡時(shí)再加強(qiáng)免疫一次豬瘟疫苗，但是疫情未見(jiàn)減輕跡象。

1.2 剖檢病變

首先可見(jiàn)病豬耳部及臀部皮膚呈紅紫色，尤其是四肢末端及豬耳尖的皮膚部分存在大面積出血；剖開(kāi)可以直觀從胸腔看到心耳密布出血點(diǎn)和心外膜有零散出血點(diǎn)分布，肺部表面有少量血斑存在；從腹腔可以看到脾臟淤血腫大且邊緣梗死有丘疹狀出血灶，腎臟為典型的 雀斑腎 密布針尖狀大小的出血點(diǎn)，結(jié)腸壁淋巴小結(jié)腫脹，漿膜和黏膜廣泛性出血，回盲瓣腫大充血和散布潰瘍?cè)睿螂桌锩娣e尿且膀胱壁上面存在大批出血灶；其他還有出現(xiàn)全身淋巴結(jié)出血腫大，切面大理石狀，扁桃體散落化膿灶等。解剖病變?nèi)鐖D1、圖2、圖3、圖4。

1.3 制定確診方案

從發(fā)病背景和剖檢病變及本實(shí)驗(yàn)室調(diào)查的山東地區(qū)豬瘟疫病流行情況上看，初診確定是豬瘟病毒感染。為了確診是豬瘟和解決該問(wèn)題制定了以下方案：首先PCR檢測(cè)和病理組織學(xué)觀察確定病原，病原檢測(cè)檢測(cè)項(xiàng)目為CSFVPRV gEPCVPRRSV。然后對(duì)免疫二次豬瘟疫苗的豬群（健康豬和非健康豬各10頭）進(jìn)行抗體檢測(cè)以評(píng)價(jià)疫苗免疫效果，抗體檢測(cè)項(xiàng)目為CSFVPRV gEPRRSV，最后進(jìn)行綜合分析。

圖2 雀斑腎 腎臟上密布出血點(diǎn)

圖3 心耳及心外膜有出血點(diǎn)

圖4 全身淋巴結(jié)均見(jiàn)充血、出血、腫大

2 材料與方法

2.1 樣品來(lái)源

樣品來(lái)源與處理，2018年4月下旬，從山東省泰安市汶口地區(qū)1 000頭育肥豬的中小規(guī)模豬場(chǎng)（僅育肥），采集血樣20份和2份病料，血清分離6 000 r/min，離心5 min，病料取肝、肺、脾、腎、淋巴結(jié)等有眼觀病變的部位加入PBS后研磨,9 000 r/min，離心3 min，置于-20 ℃冰箱凍存待檢。血樣采集來(lái)源為加強(qiáng)免疫后的發(fā)病育肥豬群中健康狀況良好的和出現(xiàn)臨床癥狀的豬只各10頭。

2.2 主要儀器及試劑

DL 2 0 0 0 DNA M a r ke r、2hGC buffer、dNTP、rTaq 酶、ddH2O；Easy Pure Viral RNA/DNA Extraction kit；進(jìn)口 MEDIAN 公司豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病毒、豬偽狂犬gE抗體檢測(cè)試劑盒，96孔血凝稀釋板，Eppendorf 移液器，酶標(biāo)儀等。

2.3 病原檢測(cè)

處理過(guò)的病料組織-80 ℃反復(fù)凍融3次，4 ℃離心機(jī)3 000 r/min高速離心，然后取上清使用杭州睿博興科DNA/RNA Extraction kit（批號(hào)：BSC67M1）提取病毒核酸。以提取的核酸作為模板，用豬圓環(huán)2型病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒gE基因、豬藍(lán)耳病病毒的鑒別引物進(jìn)行PT-PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物置于1%的凝膠瓊脂中電泳，將電泳完的凝膠進(jìn)行照膠。

2.4 病理組織學(xué)檢查

將被剖檢豬只新鮮的組織器官如脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、心臟等，分別取有明顯病變的厚度為硬幣大小的組織塊置于10%福爾馬林溶液中固定，沖水，過(guò)酒精，包埋，石蠟切片，HE染色，鏡檢。

2.5 抗體檢測(cè)

2.5.1 檢測(cè)方法

嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)所附說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，置于450 nm波長(zhǎng)下讀數(shù)。

2.5.2 判定標(biāo)準(zhǔn)

PRRSV(豬藍(lán)耳病病毒）：陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為S/P值大于等于0.4；陰性判定標(biāo)準(zhǔn)為S/P值小于0.4；PRV gE（豬偽狂犬病野毒）：陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為S/N值大于等于0.6；陰性判定標(biāo)準(zhǔn)為S/P值小于0.6；CSFV（豬瘟病毒）：陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為阻斷率大于40%；陰性判定標(biāo)準(zhǔn)為阻斷率小于40%。

3 結(jié)果與分析

3.1 病原檢查結(jié)果

用前面處理過(guò)的研磨液提取DNA/RNA后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果為兩份病料只有豬瘟病毒出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，見(jiàn)圖5。

圖5 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3.2 病理組織學(xué)結(jié)果

鏡下觀察結(jié)果為肝臟有大量淋巴壞死和肝臟淋巴壞死有嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、腦有血栓和腦血管有 袖套 現(xiàn)象、心肌充血出血、 腎間質(zhì)充血出血、肝門(mén)淋巴結(jié)出血性壞死等出血壞死性病變，符合豬瘟鏡下病理變化特征。

3.3 抗體檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)臨床表現(xiàn)將豬群分為非健康與健康(1號(hào)為非健康，2號(hào)為健康），對(duì)兩個(gè)群體分別進(jìn)行抗體檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以得出健康豬群和非健康豬群的豬瘟抗體陽(yáng)性率不高存在陰性豬只，抗體平均值只有40%多與國(guó)家的豬瘟免疫標(biāo)準(zhǔn)存在較大差距[2]。2個(gè)組的豬藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性率分別為90%和100%，平均值分別為1.18和1.46，離散度稍微偏高，完全符合國(guó)家豬藍(lán)耳病免疫標(biāo)準(zhǔn)。豬偽狂犬病陽(yáng)性率為0，抗體平均值都在0.8以上，免疫效果很好，完全符合國(guó)家豬偽狂犬病免疫標(biāo)準(zhǔn)。說(shuō)明豬瘟疫苗免疫操作或疫苗本身存在問(wèn)題。

圖6 心肌充血出血 H E，×400

圖7 腎間質(zhì)充血出血 H E，×400

圖8 肝門(mén)淋巴結(jié)出血性壞死 H E，×400

圖9 肝臟有大量淋巴壞死 H E，×400

表1 3種抗體檢測(cè)統(tǒng)計(jì)表

4 結(jié)論

根據(jù)臨床表現(xiàn)、剖檢病變、病理組織學(xué)檢查及病原學(xué)檢查和血清學(xué)檢測(cè)，最后診斷確定為豬瘟病毒感染。病原學(xué)檢查豬瘟單一陽(yáng)性，血清學(xué)檢測(cè)豬藍(lán)耳病和豬偽狂犬病抗體水平較好完全符合國(guó)家免疫標(biāo)準(zhǔn)。豬瘟疫苗免疫一般情況下，抗體水平達(dá)到較高水平可以為豬群提供足夠保護(hù)力[3]，但本豬群在豬瘟疫苗二次免疫兩周后的豬瘟抗體水平仍然較低，不能夠?yàn)樨i群提供應(yīng)有的保護(hù)，造成豬群大量感染豬瘟病毒，繼而出現(xiàn)高發(fā)病率、高死亡率?？梢酝茰y(cè)為豬瘟疫苗免疫效果不佳，另外也不能排除免疫抑制的情況。建議豬場(chǎng)將豬瘟疫苗送專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行疫苗測(cè)評(píng)，同時(shí)可以將一小部分健康豬只緊急免疫另一種豬瘟疫苗，在飼料中添加恩諾沙星和維生素C等提高免疫力，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格消毒，防止繼發(fā)感染其他病原。

豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒4類病毒目前仍是我國(guó)豬場(chǎng)最難應(yīng)對(duì)的病原，這4類病毒一但在豬場(chǎng)流行就會(huì)造成大規(guī)模的傷亡，尤其中小規(guī)模豬場(chǎng)缺乏技術(shù)指導(dǎo)，在豬場(chǎng)暴發(fā)大規(guī)模流行病時(shí)，往往出現(xiàn)應(yīng)對(duì)措施不足和找不到發(fā)病原因。所以本實(shí)驗(yàn)針對(duì)該類問(wèn)題制定的診斷方案，通過(guò)3種檢測(cè)方法嚴(yán)格驗(yàn)證了該豬場(chǎng)感染了豬瘟病毒，并且將問(wèn)題根源鎖定在免疫和疫苗方面。提供的診斷方案和解決措施也為出現(xiàn)該類情況的豬場(chǎng)提供了應(yīng)對(duì)措施方面的參考。