轉(zhuǎn)B、T淋巴細(xì)胞衰減子基因樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受的作用及機(jī)制

李軍良，郭天康，張東，黃軍悅，田宏偉，王濤

（甘肅省人民醫(yī)院 1. 普通外科 2. 醫(yī)療質(zhì)量控制科 3. 腎內(nèi)科，甘肅 蘭州 730030）

B、T淋巴細(xì)胞衰減子（BTLA）是免疫球蛋白超家族成員，與皰疹病毒侵入介質(zhì)（HVEM）結(jié)合提供T淋巴細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)第2信號，BTLA在體內(nèi)廣泛表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）和巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞表面。已有研究[1-7]表明BTLA信號通路在炎癥免疫調(diào)控、腫瘤免疫逃避和自身免疫性疾病中起到重要作用，但BTLA信號通路和肝臟移植物的免疫耐受間的相關(guān)性尚缺乏研究。本研究擬采用慢病毒介導(dǎo)BTLA基因轉(zhuǎn)染DC后回輸肝移植術(shù)后大鼠，觀察其對移植肝臟的免疫保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

供體為DA大鼠，體質(zhì)量18～220 g，受體為Lewis大鼠，體質(zhì)量250～300 g，均為雄性，SPF級，由北京維通利華公司提供，實(shí)驗(yàn)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)室完成，實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程符合實(shí)驗(yàn)動物倫理相關(guān)規(guī)定。

1.2 BTLA慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)GeneBank公布的大鼠BTLA基因mRNA序列（NM_213630.1），委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成引物，構(gòu)建ORF慢病毒表達(dá)質(zhì)粒LV-BTLA，繼而構(gòu)建慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400，用此慢病毒感染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后使用熒光顯微鏡進(jìn)行綠色熒光蛋白觀察。

1.3 目標(biāo)DC的獲取和鑒定[8]

D A大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，1250 U肝素陰莖背靜脈注射，腹主動脈抽血共計20 mL，加入大鼠淋巴細(xì)胞分離液600 g離心20 min，取淋巴細(xì)胞層清洗2次，用含100 ml/L胎牛血清的RPM11640懸浮細(xì)胞，加入20 ng/mL GMCSF、10 ng/mL IL-4、4 μg/L的重組大鼠TNF-α（recombinant rat tumor necrosis factor α，rrTNF-α），1 mL/L雙抗（鏈霉素、青霉素），37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。隔日半量換液，10 d后可見半懸浮狀態(tài)成團(tuán)聚集的細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD80、CD86、MHCII、OX62的表達(dá)。

1.4 慢病毒和DC共培養(yǎng)及BTLA的表達(dá)鑒定

取上述培養(yǎng)5 d后的DC細(xì)胞將其收集于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后以感染復(fù)數(shù)為15向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入攜帶BTLA基因的重組慢病毒液，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后Western blot法檢測BTLA在修飾DC細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平，使用Image J軟件進(jìn)行圖像處理分析。

1.5 大鼠原位肝移植模型的建立[9-11]

1.5.1 供體手術(shù) DA大鼠10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉后仰臥位膠布固定，肋緣下T字型切口入腹，順時針游離供肝，依次切斷右三角韌帶、冠狀韌帶，結(jié)扎并切斷左膈下靜脈、肝和食管間的交通支血管，結(jié)扎并切斷幽門靜脈，經(jīng)陰莖背靜脈注射1250 U肝素液完成供體肝素化。貼近下腔靜脈結(jié)扎右腎上腺靜脈，分離并結(jié)扎切斷右腎靜脈。暴露肝門，左右肝管匯合部下方5 mm V字形剪開膽總管前壁置入膽管內(nèi)支架，5-0絲線固定。穿刺腹主動脈置入小兒頭皮針并血管夾固定，0～4 ℃乳酸鈉林格氏液20 mL（含肝素5 U/mL）緩慢灌注，剪開膈肌，阻斷胸主動脈，剪開右心耳放血，完成供肝灌注。緊貼肝上下腔靜脈膈肌環(huán)離斷肝上下腔靜脈，脾靜脈交匯上方離斷門靜脈，左腎靜脈上方離斷肝下下腔靜脈，完成供肝摘取。

1.5.2 供肝修整 冰鹽水中修剪肝上膈肌環(huán)，完整去除膈肌。肝下下腔靜脈置入6.7-F心臟導(dǎo)管外鞘制成的套管并5-0絲線固定，門靜脈內(nèi)置入5.6-F心臟導(dǎo)管外鞘制成的套管并5-0絲線固定，至此完成供肝修整。

1.5.3 受體手術(shù) Lewis大鼠術(shù)前30 min肌注0.03 mg阿托品，10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉滿意后仰臥位膠布固定，取上腹正中切口。游離并依次切斷肝周韌帶，肝固有動脈起始段結(jié)扎并切斷。左右肝管匯合處離斷膽總管遠(yuǎn)端置入膽管內(nèi)支架并5-0絲線活結(jié)臨時固定。緊貼肝下下腔靜脈結(jié)扎右腎上腺靜脈，右腎靜脈上方哈巴狗血管夾阻斷下腔靜脈，幽門靜脈上方血管夾阻斷門靜脈，穿刺門靜脈分叉處緩慢推注2 mL生理鹽水完成自身輸血。小兒Satinsky鉗帶少量膈肌阻斷肝上下腔靜脈，門靜脈分叉處離斷門靜脈，緊貼肝臟離斷肝下下腔靜脈，摘除受體肝臟。移入供肝8-0絲線兩定點(diǎn)法完成肝上下腔靜脈端端吻合，門靜脈斷端套入供體套管并5-0絲線固定，開放受體門靜脈阻斷鉗和肝上下腔靜脈阻斷鉗結(jié)束無肝期，可見肝臟顏色緩慢變紅。同法套入肝下下腔靜脈并開放右腎靜脈上方血管夾，可見右腎顏色緩慢復(fù)原。拆除受體膽總管支架，套入供體膽總管支架完成膽總管重建，至此完成受體肝臟移植。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組和檢測指標(biāo)

將36只模型大鼠分為3組，每組12只。模型組：僅行原位大鼠肝移植，術(shù)后不作任何處理；DC組：受體Lewis大鼠行肝移植術(shù)后即刻、術(shù)后3 d經(jīng)尾靜脈回輸無B T L A基因的重組慢病毒Lv.GFP轉(zhuǎn)染的DC細(xì)胞；BTLA-DC組：受體Lewis大鼠行肝移植術(shù)后即刻、術(shù)后3 d經(jīng)尾靜脈回輸重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染的DC細(xì)胞。以上3組各6只大鼠于術(shù)后3、7 d尾靜脈采血全自動生化儀檢測天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（TBIL），術(shù)后7 d尾靜脈采血ELISA檢測血清白細(xì)胞介素10（IL-10）、干擾素（IFN-γ）含量。每組2只大鼠術(shù)后7 d吸入乙醚麻醉后摘取供肝，10%福爾馬林4 ℃固定過夜，石蠟包埋，切片4 μm厚，經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察供肝病理改變，參照肝移植排斥反應(yīng)Banff標(biāo)準(zhǔn)。其余每組6只用于生存分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有資料用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，受體大鼠生存時間采用Kaplan-Meier生存曲線分析并用Log-rank秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 DC細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定

隔日半量換液1次，培養(yǎng)10 d后顯微鏡下觀察可見成團(tuán)聚集呈懸浮狀態(tài)的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CD80、CD86、MHCII、OX62的表達(dá)分別為41.79%，55.18%，57.93%，61.77%，為成熟DC（mDC）的特征（圖1）。

2.2 重組慢病毒LPP-Mm26645-Lv203-400轉(zhuǎn)染DC

LPP-Mm26645-Lv203-400與Lv.GFP感 染293T細(xì)胞48 h后倒置熒光顯微鏡下可見明顯的綠色熒光蛋白表達(dá)。取被轉(zhuǎn)染的DC行Western blot檢測BTLA蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，攜帶BTLA基因重組慢病毒載體感染的DC較空白對照DC與不攜帶BTLA基因重組慢病毒載體感染的DC的BTLA蛋白表達(dá)含量明顯升高，Image J軟件行灰度分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測mDC細(xì)胞表面分子標(biāo)志物Figure1 Surface molecular markers of mDCs determined by flow cytometry

2.3 造模情況

本組共完成大鼠原位異體肝移植模型36例（圖3），以術(shù)后存活72 h以上視為模型成功，成功率100%。其中供體手術(shù)時間（22.5±3.0）min，受體手術(shù)時間（67.1±5.2）m i n，受體無肝期（18.7±1.9）m i n，供肝冷缺血時間（52.0±3.9）min。

2.4 術(shù)后血清學(xué)指標(biāo)變化

肝移植術(shù)后受體大鼠血清AST、ALT、TBIL、IL-10，IFN-γ含量變化見圖4。術(shù)后3、7 d，BTLA-DC組的ALT、AST、TBIL水平均明顯低于模型組和DC組（均P＜0.05），術(shù)后3 d，DC組ALT、AST、TBIL水平與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.436、0.082、0.624），但術(shù)后7 d的ALT、AST、TBIL水平均明顯高于模型組（均P＜0.05）。與模型組比較，BTLA-DC組術(shù)后7 d的IFN-γ水平明顯降低、IL-10水平明顯升高（均P＜0.05），DC組術(shù)后7 d的IFN-γ水平明顯升高、IL-10水平明顯降低（均P＜0.05）。

圖4 各組大鼠肝移植術(shù)后血清學(xué)指標(biāo)變化Figure4 Changes in serum biochemical variables in each group of rats after liver transplantation

2.5 病理學(xué)檢查結(jié)果

移植肝病理檢查結(jié)果顯示，模型組與DC組匯管區(qū)大量淋巴細(xì)胞浸潤，累及周圍肝實(shí)質(zhì)，膽管上皮可見炎性細(xì)胞浸潤，肝靜脈內(nèi)膜下炎細(xì)胞浸潤明顯，而BTLA-DC組匯管區(qū)和膽管上皮少量炎性細(xì)胞浸潤。按Banff方案肝移植術(shù)后病理評價。模型組術(shù)后7 d RAI評分平均為7分，為III級重度排斥反應(yīng)。DC組術(shù)后7 d RAI評分平均為8分，為III級重度排斥反應(yīng)。BTLA-DC組術(shù)后7 d RAI評分1～2分，為I級輕度排斥反應(yīng)（圖5）。

圖5 移植肝臟HE染色（×400） A：模型組；B：DC組；C：BTLA-DC組Figure5 HE staining of the liver transplants (×400) A:Model group; B:DC group; C:BTLA-DC group

2.6 生存分析

模型組的中位生存時間為15 d，DC組的中位生存時間為13 d，BTLA-DC組的中位生存時間為79 d，3組的累積生存率曲線差異有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=16.14，P=0.0003）（圖6）。

圖6 各組肝移植術(shù)后大鼠生存曲線Figure6 Survival curves of each group of rats after liver transplantation

3 討 論

肝臟移植已經(jīng)成為治療各種終末期肝病的最有效的方法之一，然而，排斥反應(yīng)的發(fā)生限制了移植肝和受體的長期存活。臨床上應(yīng)用各種免疫抑制藥物預(yù)防排斥反應(yīng)已經(jīng)取得了不錯的療效，但是長期服用免疫抑制劑會誘發(fā)血壓升高、血糖升高，感染機(jī)率增高，腫瘤發(fā)生率增高等，甚至?xí)饑?yán)重的肝腎功能損害[12-13]。因此，尋找新的免疫耐受方案成為合理的選擇，并有望最終替代免疫抑制類藥物的使用。

T細(xì)胞作為肝臟移植免疫排斥的主要效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮作用，T細(xì)胞的激活需要雙信號通路[14]，以往免疫耐受研究主要集中在正向刺激信號的阻斷[15-16]，近年來負(fù)性共刺激通路BTLA的作用逐漸受到重視[17-19]，Grabmeier-Pfistershammer等[20]報道使用抗體阻斷BTLA信號通路可以有效上調(diào)HIV感染患者的CD8+T細(xì)胞數(shù)量。Simon等[21]報道BTLA高表達(dá)的DC可以有效的上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量。人體中存在多種抗原呈遞細(xì)胞（APC），DC是迄今為止所知的呈遞抗原能力最強(qiáng)的APC。DC的功能具有復(fù)雜性[22-23]，未成熟DC（imDC）表面低表達(dá)共刺激分子OX80、XO86、MHCII，與T細(xì)胞結(jié)合后不能有效傳遞第二信號，從而導(dǎo)致T細(xì)胞發(fā)生抗原特異性免疫耐受。mDC細(xì)胞表面高表達(dá)共刺激分子OX80、XO86、MHCII，可以有效傳遞T細(xì)胞激活的第二信號。經(jīng)典理論[24]認(rèn)為基于細(xì)胞因子分泌情況和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況，T細(xì)胞可以向分泌IFN-γ和IL-2的Th1細(xì)胞分化，從而引起移植肝細(xì)胞的損傷，也可以向分泌IL-4和IL-10為主的Th2細(xì)胞分化，從而抑制對移植肝細(xì)胞的損傷?；诨蚬こ痰姆椒ㄐ揎桪C細(xì)胞被認(rèn)為是最有前景的免疫治療方法之一[25]。

本研究采用BTLA基因的重組質(zhì)粒，利用慢病毒作為載體，和供體來源的DA大鼠DC細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)后經(jīng)陰莖背靜脈回輸入肝移植術(shù)后大鼠，慢病毒介導(dǎo)的BTLA基因高表達(dá)的BTLA-DC組術(shù)后3、7 d的ALT、AST、TBIL較模型組和DC組明顯降低。代表Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-10的含量較模型組和DC組明顯升高。術(shù)后7 d移植肝臟的病理改變較模型組和DC組的RAI評分明顯減低。DC組較模型組在7 d時的ALT、AST、TBIL明顯升高，代表Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ較模型組明顯增高，移植肝臟病理評分也明顯增高，說明單純輸注DC細(xì)胞會進(jìn)一步增強(qiáng)免疫排斥反應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，高表達(dá)BTLA的DC細(xì)胞會誘導(dǎo)Th1/Th2細(xì)胞漂移，進(jìn)而導(dǎo)致T細(xì)胞對移植肝臟產(chǎn)生抗原特異性免疫耐受，本研究有助于揭示修飾DC負(fù)性通路導(dǎo)致肝移植免疫耐受的機(jī)制，從而為肝臟移植免疫耐受提供一種可能的新方法。