預(yù)包裝中藥代煎劑微生物限度檢查方法研究

沙禕煒 張學(xué)博 郁愛萍 陸春勝

中藥煎煮劑是中藥口服處方的常用種類, 現(xiàn)今大多數(shù)中藥煎煮劑都采取代加工的方式生產(chǎn), 即稱為預(yù)包裝中藥代煎劑, 目前對于該類產(chǎn)品沒有規(guī)定進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn), 而中藥代煎劑的生產(chǎn)環(huán)境和關(guān)鍵工藝如控制不嚴(yán), 極有可能對中藥煎煮劑終產(chǎn)品的衛(wèi)生質(zhì)量提出挑戰(zhàn)［1-3］, 尤其是芽孢桿菌、霉菌和酵母菌等耐高滲透壓和耐熱性微生物［4-6］的殘留, 以及預(yù)包裝中藥代煎劑采用“一次制備, 分次服用”的形式,也可能會(huì)造成部分微生物的復(fù)蘇、繁殖, 甚至產(chǎn)生毒素［7］,造成對人體不可挽回的傷害。根據(jù)中華人民共和國藥典(2015年版)四部［8］通則微生物限度檢查法(1105、1106、1107)的相關(guān)規(guī)定, 對預(yù)包裝中藥代煎劑中微生物情況進(jìn)行研究,從需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)及霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù), 控制菌中大腸埃希菌檢查法著手, 建立通用性的微生物限度檢查方法。

1 材料與方法

1.1 樣品及培養(yǎng)基等 預(yù)包裝中藥代煎劑(上海青浦中藥飲片廠, 批號：20180626)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)、麥康凱液體培養(yǎng)基、TSB、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB)、pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；0.9 %無菌氯化鈉溶液自備。

1.2 儀器設(shè)備 SN310C型高壓蒸汽滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司, 重慶)、MJ-180B型霉菌培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠, 上海)、AC2-6S1型生物安全柜(ESCO, 新加坡)、MJX-100B-Z型霉菌培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠 , 上海 )。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌種 黑曲霉(aspergillus niger)［來源：CMCC(F)98003］、金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［來源：CMCC(B)26003］、銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa)［來源：CMCC(B)10104］、大腸埃希菌(escherichia coli)［來源：CMCC(B)44102］、白色念珠菌(candida albicans)［來源：CMCC(F)98001］和枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)［來源：CMCC(B)63501］均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.4 菌液的制備 用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)24 h(35℃)后, 用0.9%無菌氯化鈉溶液進(jìn)行10倍稀釋上述1 ml的培養(yǎng)物, 分別稀釋成菌懸液為1000～10000 CFU/ml(其中大腸埃希菌約為≤100 CFU/ml的菌懸液)；用白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)2 d(25℃)后, 用0.9%無菌氯化鈉溶液進(jìn)行10倍稀釋上述1 ml的培養(yǎng)物, 稀釋成菌懸液為1000～10000 CFU/ml；用黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)6 d(25℃)后, 用0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫并進(jìn)行10倍稀釋上述孢子懸液, 稀釋成孢子懸液為1000～10000 CFU/ml。

1.5 供試液和培養(yǎng)基的制備 取預(yù)包裝中藥代煎劑樣品1袋, 充分搖勻后, 立即吸取10 ml的樣品溶液置于含100 ml pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液的已滅菌密蓋容器中, 充分振搖蕩洗≥10 min后, 放置待沉淀下降取上層液即制備成供試液(1∶10)。

1.6 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

1.6.1 需氧菌總數(shù)測定

1.6.1.1 試驗(yàn)組 取1∶10供試液9.9 ml和銅綠假單胞菌懸液0.1 ml混合, 吸取1 ml上述供試液平均放入5個(gè)平皿(0.2 ml/皿)后, 立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基后, 再35℃培養(yǎng)≤3 d, 加和所有平皿后合計(jì)銅綠假單胞菌數(shù)。另取金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌同法操作；黑曲霉和白色念珠菌培養(yǎng)前同法操作, 其后培養(yǎng)時(shí)間≤5 d。

1.6.1.2 菌液對照組 分別取上述5種菌懸液(孢子懸液)0.1 ml和9.9 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液混勻,分別吸取1 ml上述供試液平均放入5個(gè)平皿(0.2 ml/皿)后,立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基后培養(yǎng), 同法計(jì)數(shù)。

1.6.1.3 供試品對照組 取1∶10供試液, 用無菌pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液代替菌液吸取1 ml上述供試液平均放入5個(gè)平皿(0.2 ml/皿)后, 立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基后培養(yǎng), 同法計(jì)數(shù)。

1.6.1.4 回收試驗(yàn) 5種標(biāo)準(zhǔn)菌種在試驗(yàn)組、菌液對照組中平行操作各2次, 供試品對照組平行制備2份。

1.6.2 霉菌和酵母菌總數(shù)測定

1.6.2.1 試驗(yàn)組 取1∶10供試液9.9 ml和白色念珠菌菌懸液0.1 ml混合, 取混合液1 ml分注5個(gè)平皿, 0.2 ml/皿,立即傾注SDA, 置規(guī)定溫度培養(yǎng), 以5個(gè)平皿菌落總和計(jì)數(shù)。另取黑曲霉孢子懸液同法操作。

1.6.2.2 菌液對照組 分別取上述兩種菌懸液(孢子懸液)0.1 ml和9.9 ml pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液混勻,吸取1 ml上述供試液平均放入5個(gè)平皿(0.2 ml/皿)后, 立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基后培養(yǎng), 同法計(jì)數(shù)。

1.6.2.3 供試品對照組 取1∶10供試液, 用無菌pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液代替菌液吸取1 ml上述供試液平均放入5個(gè)平皿(0.2 ml/皿)后, 立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基后培養(yǎng), 同法計(jì)數(shù)。

1.6.2.4 回收試驗(yàn) 2種標(biāo)準(zhǔn)菌種在試驗(yàn)組、菌液對照組中平行操作各2次, 供試品對照組平行制備2份。

1.7 控制菌大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn)

1.7.1 試驗(yàn)組 在100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中同時(shí)接種1 ml大腸埃希菌菌液和上述供試液(1∶10)10 ml, 經(jīng)增菌培養(yǎng)1 d(35℃)后, 在100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接上述1 ml增菌液, 繼續(xù)培養(yǎng)2 d(43℃)后, 直接在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線轉(zhuǎn)接, 最后培養(yǎng)3 d(35℃)即得。

1.7.2 陽性對照組 在100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中同時(shí)接種1 ml大腸埃希菌菌液和pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 ml, 經(jīng)增菌培養(yǎng)1 d(35℃)后, 在100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接上述1 ml增菌液, 繼續(xù)培養(yǎng)2 d(43℃)后, 直接在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線轉(zhuǎn)接, 最后培養(yǎng)3 d(35℃)即得。

1.7.3 陰性對照組 在100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中直接接種pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 ml, 經(jīng)增菌培養(yǎng)1 d(35℃)后, 在100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接上述1 ml增菌液, 繼續(xù)培養(yǎng)2 d(43℃)后, 直接在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線轉(zhuǎn)接, 最后培養(yǎng)3 d(35℃)即得。

1.7.4 結(jié)果 試驗(yàn)組中生長的大腸埃希菌通過生化和分子生物學(xué)鑒定后確證；陽性對照組大腸埃希菌生長良好；陰性對照組無菌落生長。

2 結(jié)果

2.1 微生物限度檢查法方法適用性試驗(yàn)結(jié)果判定 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)試驗(yàn)組各個(gè)目標(biāo)菌的菌數(shù)回收比值在0.5～2.0, 控制菌檢查試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌大腸埃希菌, 符合中國藥典2015年版的要求。見表1, 表2。

表1 需氧菌總數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

表2 霉菌和酵母菌總數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

2.2 微生物限度檢查法的建立 按照本文研究的方法適用性結(jié)果, 預(yù)包裝中藥代煎劑的通用性微生物限度檢查方法為：取預(yù)包裝中藥代煎劑樣品1袋, 充分搖勻后, 立即吸取10 ml的樣品溶液置于含100 ml pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液的已滅菌密蓋容器中, 充分振搖蕩洗≥10 min后, 放置待沉淀下降取上層液即制備成供試液(1∶10), 用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 ml/皿)進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)及霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)；取1∶10的供試液10 ml, 接種至100 ml TSB中, 進(jìn)行大腸埃希菌檢查。

3 討論

3.1 預(yù)包裝中藥代煎劑樣品的選擇, 根據(jù)國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》中篩選了4種：“麻黃湯”、“芍藥甘草湯”、“小承氣湯”和“澤瀉湯”分別進(jìn)行試驗(yàn), 都滿足要求。

3.2 預(yù)包裝中藥代煎劑樣品的制備, 從原料中藥飲片到成品預(yù)包裝中藥代煎劑, 都處于完全模擬委托代煎的全流程操作過程［9-14］。

3.3 供試品前處理法首先考慮薄膜過濾法, 由于供試品看似溶液狀態(tài)但是含有較多很細(xì)小的不溶性藥物殘?jiān)鼰o法濾過薄膜；后直接用常規(guī)平皿傾注法但試驗(yàn)菌回收試驗(yàn)比值不滿足要求。采用液體培養(yǎng)基直接稀釋法, 取樣品10 ml直接接種到200 ml TSB中培養(yǎng)和取樣品20 ml直接接種到500 mlTSB中培養(yǎng)等方法陽性菌均不明顯生長。