硒多糖對MCF-7乳腺癌小鼠的抗腫瘤作用研究

薛玲 劉祥東 付思雨 李震 羅曉慶

摘要：目的? 探究硒多糖對MCF-7乳腺癌小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及SBP-1表達的影響，分析硒多糖對乳腺癌小鼠的抑瘤效果及作用機制。方法? 將40只小鼠隨機分為4組，每組10只，其中1組作為正常組，其余3組將MCF-7乳腺癌細胞懸液注射于小鼠左側(cè)膈腧穴處建立乳腺癌模型，證明成瘤后予以給藥，模型組（予等劑量的生理鹽水），硒多糖用藥組（400 mg/kg硒多糖）、聯(lián)合用藥組（50 mg/kg環(huán)磷酰胺+400 mg/kg硒多糖），連續(xù)給藥14 d。脫頸處死小鼠，測胸腺指數(shù)、脾指數(shù)，無菌條件下取脾臟研磨進行體外淋巴細胞培養(yǎng)，檢測PHA誘導(dǎo)下的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率并應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測腫瘤組織中SBP-1的表達情況。結(jié)果? 與正常組和模型組相比較硒多糖用藥組、聯(lián)合用藥組的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)及淋巴細胞轉(zhuǎn)化率明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與硒多糖用藥組比較聯(lián)合用藥組的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)及淋巴細胞轉(zhuǎn)化率均有所提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比硒多糖用藥組及聯(lián)合用藥組的SBP-1蛋白表達均有所提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與硒多糖用藥組相比聯(lián)合用藥組的SBP-1蛋白表達有所增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? 硒多糖可以通過改善MCF-7乳腺癌小鼠的免疫功能及增強SBP-1的表達來起到抗腫瘤作用，與環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥作用更顯著。

關(guān)鍵詞：硒多糖;抗腫瘤;乳腺癌;SBP-1蛋白

中圖分類號：R737.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.024

文章編號：1006-1959（2019）01-0073-04

Anti-tumor Effect of Selenium Polysaccharide on MCF-7 Breast Cancer Mice

XUE Ling，LIU Xiang-dong，F(xiàn)U Si-yu，LI Zhen，LUO Xiao-qing

（Qiqihar Medical College，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China）

Abstract：Objective? To investigate the effects of selenium polysaccharide on spleen index， thymus index， spleen lymphocyte transformation rate and SBP-1 expression in MCF-7 breast cancer mice， and to analyze the anti-tumor effect and mechanism of selenium polysaccharide on breast cancer mice. Methods? 40 mice were randomly divided into 4 groups， 10 in each group， 1 of which was used as the normal group. The other 3 groups were injected with MCF-7 breast cancer cell suspension into the left axillary cavity of mice to establish a breast cancer model. It was proved to be administered after tumor formation， model group （administered with equal dose of normal saline）， selenium polysaccharide treatment group （400 mg/kg selenosaccharide）， and combination group （50 mg/kg cyclophosphamide + 400 mg/kg selenosaccharide） ， continuous administration for 14 d. The mice were killed， thymus index and spleen index were measured， spleen was ground to culture lymphocytes in vitro under aseptic condition. The transformation rate of spleen lymphocytes induced by PHA and the expression of SBP-1 in tumor tissues were detected by immunohistochemistry.Results? Compared with the normal group and the model group， the thymus index， spleen index and lymphocyte transformation rate of the selenopolysaccharide group and the combination group were significantly increased （P<0.05）; compared with the selenopolysaccharide group. The thymus index， spleen index and lymphocyte transformation rate of the group were increased， the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the model group， the SBP-1 protein expression in the selenopolysaccharide group and the combination group was compared，the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the selenium polysaccharide group， the expression of SBP-1 protein was enhanced，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? Selenium polysaccharide can play an anti-tumor effect by improving the immune function of MCF-7 breast cancer mice and enhancing the expression of SBP-1. The combination with cyclophosphamide is more significant.

Key words：Selenium polysaccharide;Anti-tumor;Breast cancer;SBP-1 protein

乳腺癌（breast cancer）是女性最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前，西醫(yī)針對乳腺癌的治療手段主要包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療等，無論是腫瘤本身還是各種治療手段均會給患者的生活和工作造成嚴重影響[2]。乳腺癌的發(fā)病率高，危害大，日益受到研究者的廣泛關(guān)注。硒是機體生理活動必需的微量元素之一，在提高機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤方面均發(fā)揮著重要作用[3]。硒多糖作為一種有機硒化合物，既保持了多糖較高的生物利用率又具有硒的生物功能，對生物體的毒性大大降低，且活性明顯高于硒和多糖[4]。硒多糖具有調(diào)節(jié)健康小鼠免疫功能的作用[5]，但硒多糖能夠抑制乳腺癌細胞增殖的機制未見詳細報道。硒結(jié)合蛋白1（selenium binding protein，SBP-1）是體內(nèi)硒結(jié)合蛋白的一種，較正常組織相比，SBP-1在腫瘤組織中表達減少[6，7]。研究表明，SBP-1的表達增高有助于增強機體的抗癌能力，SBP-1可以成為乳腺癌的臨床診斷和預(yù)后判斷的指標[8]。本研究通過探討硒多糖對MCF-7乳腺癌小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及SBP-1表達的影響，進一步探明硒多糖調(diào)節(jié)荷瘤機體免疫功能及抗腫瘤的機制，從而對硒多糖抗乳腺癌作用的相關(guān)性進行研究，為腫瘤的預(yù)防及免疫治療提供新方向。

1材料與方法

1.1實驗動物? 健康的雌性BALB/c小鼠40只，普通級，4～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，均由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，本實驗已經(jīng)動物倫理委員會批準研究。

1.2主要試劑? MCF-7乳腺癌細胞株（由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究所惠贈）;RPMI1640完全培養(yǎng)基（購自美國Gibco）;胎牛血清（購自杭州四季青生物公司）;紅細胞裂解液（購自Biosharp）;MTT、二甲基亞砜（購自北京索萊寶生物公司）;硒多糖（購自湖北天夏生物工程有限公司）;環(huán)磷酰胺（購自通化茂祥制藥有限公司）;SBP1抗體（購自上海康朗生物科技有限公司）;免疫組化試劑盒（購自福州邁新）。

1.3主要儀器? 電子天平;倒置相差顯微鏡;超凈工作臺;離心機;CO2恒溫培養(yǎng)箱;恒溫水浴箱;高壓鍋;超低溫冰箱（-80%）;酶標儀;石蠟切片機;光學(xué)顯微鏡。

1.4方法

1.4.1動物分組? 按體重進行蛇形分組，隨機分為4組：正常組、模型組、硒多糖用藥組、聯(lián)合用藥組，每組10只。

1.4.2造模? 將MCF-7乳腺癌細胞傳代培養(yǎng)，取生長良好的細胞，將細胞濃度調(diào)整至1×107個/ml，按0.1 ml/只于除正常組外其他3組小鼠的左側(cè)膈腧穴處進行注射接種，從而建立小鼠乳腺癌模型[9，10]，正常組不建立乳腺癌模型。15 d后在可觸及皮下腫瘤時證明已完成乳腺癌模型種植。

1.4.3給藥? 硒多糖用藥組以400 mg/kg的硒多糖劑量予以給藥[5];聯(lián)合用藥組以50 mg/kg的環(huán)磷酰胺，1次/2 d[11]以及400 mg/kg的硒多糖予以給藥;模型組予以等劑量的生理鹽水;正常組不予任何藥物處理，給藥方式均為灌胃給藥，連續(xù)給藥14 d。

1.4.4測胸腺指數(shù)、脾指數(shù)? 用藥結(jié)束后，用電子天平分別測量單只小鼠的體質(zhì)量，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠的胸腺、脾臟，計算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)。

1.4.5檢測小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率? 取無菌脾臟研磨進行體外淋巴細胞培養(yǎng)，制成單個細胞懸液，將細胞濃度調(diào)整為3×106個/ml，并加入24孔培養(yǎng)板中（每孔1 ml），將其分為實驗組（每孔加50 μl PHA液）和對照組（不加PHA），置5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h。取出，每孔吸去上清液0.7 ml，隨后加入0.7 ml不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液及5 mg/ml的MTT 50 μl/孔，繼續(xù)置5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取出，加入二甲亞砜1 ml/孔，然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔分裝3孔作為平行樣，用酶標儀在570 nm波長下測定光密度（OD）值。

1.4.6檢測腫瘤組織中SBP-1的表達? 取模型組、硒多糖用藥組、聯(lián)合用藥組的腫瘤組織于10%甲醛溶液中固定，梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、常規(guī)石蠟包埋、切片機切片、烤片、脫蠟、高壓法修復(fù)抗原，應(yīng)用Envision免疫組化試劑盒對切片進行染色，并滴加DAB顯色劑顯色，鏡下控制顯色時間并用自來水終止顯色。隨后用蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察各組腫瘤組織中SBP-1的表達情況，并應(yīng)用Image-Pro Plus軟件進行圖片數(shù)據(jù)分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法? 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，以（x±s）表示，組間比較用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的比較? 與正常組相比硒多糖用藥組、聯(lián)合用藥組的胸腺指數(shù)與脾指數(shù)均有所增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比硒多糖用藥組、聯(lián)合用藥組的胸腺指數(shù)與脾指數(shù)亦有所提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與硒多糖用藥組相比聯(lián)合用藥組的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均有所提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明硒多糖可以改善乳腺癌小鼠的免疫功能，與CTX聯(lián)合用藥可以起到增效減毒的作用。見表1。

2.2各組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率比較? 與正常組相比硒多糖用藥組、聯(lián)合用藥組的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率均有所提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比硒多糖用藥組、聯(lián)合用藥組的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率亦有所提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與硒多糖用藥組相比聯(lián)合用藥組的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明硒多糖可以改善乳腺癌小鼠的免疫功能，與CTX聯(lián)合用藥可以起到增效減毒的作用。見表2。

2.3腫瘤組織中SBP-1的表達情況? 應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分別對模型組、硒多糖用藥組、聯(lián)合用藥組SBP-1的表達情況進行檢測，結(jié)果用平均光密度值（Mean of IOD）表示。SBP-1蛋白表達于細胞的胞漿和胞核，呈棕黃色顆粒（圖1～圖3）：與模型組相比硒多糖用藥組、聯(lián)合用藥組的SBP-1表達有所提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與硒多糖用藥組相比聯(lián)合用藥組的SBP-1表達亦有所提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明硒多糖可以通過增強SBP-1的表達來起到抗腫瘤作用，與CTX聯(lián)合用藥作用更顯著。見表3。

3討論

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是危害女性健康的常見疾病，其發(fā)病率、死亡率均位居前列[12]。乳腺癌的發(fā)生主要與內(nèi)分泌激素功能紊亂、遺傳因素、生育哺乳及營養(yǎng)因素等有關(guān)。目前針對乳腺癌的治療方法主要有手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、化學(xué)藥物治療、放射治療、分子靶向治療等，其中化療已成為乳腺癌病程各期的積極治療措施[13，14]。乳腺癌雖對化療藥物敏感，但在許多研究中發(fā)現(xiàn)其并未有效提高患者生存率[15]，目前我們針對乳腺癌化療藥物的認知仍不全面，還有待進一步研究。

環(huán)磷酰胺作為一種廣譜的抗腫瘤藥物，在乳腺癌的治療中發(fā)揮著重要作用[16]。硒多糖作為一種安全有效的免疫調(diào)節(jié)劑，具有多種生物活性，毒副作用小，擁有不可估量的研究價值[17]。本文通過對BALB/c小鼠建立乳腺癌模型，測定小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及腫瘤組織中SBP-1的表達情況，從細胞免疫及腫瘤組織中SBP-1的表達方面探討了硒多糖對MCF-7乳腺癌小鼠的抑瘤作用機制。但本實驗僅檢測了乳腺癌小鼠的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及SBP-1的表達，今后我們還會進一步檢測乳腺癌小鼠的脾NK細胞活性及抗體積數(shù)，探討硒多糖是否通過提高細胞免疫、體液免疫功能及增強NK細胞的殺傷活性來增強荷瘤機體的免疫力，為腫瘤的預(yù)防和免疫治療提供新方向。

通過對各組乳腺癌小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的比較表明，硒多糖用藥組及聯(lián)合用藥組的脾指數(shù)及胸腺指數(shù)均有所提高，且相比較硒多糖用藥組聯(lián)合用藥組效果更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;通過對各組脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的比較表明，硒多糖用藥組及聯(lián)合用藥組的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率均有所提高，且相比于硒多糖用藥組聯(lián)合用藥組效果更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;通過對各組腫瘤組織中SBP-1表達情況的分析表明，硒多糖用藥組及聯(lián)合用藥組SBP-1的表達均有所增強，相比較硒多糖用藥組聯(lián)合用藥組的效果更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。上述結(jié)果表明，硒多糖可以提高乳腺癌小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及SBP-1的表達從而起到抑瘤作用，在與環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥時效果更顯著。

綜上所述，硒多糖可以提高乳腺癌小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，從而在一定程度上增強乳腺癌小鼠的免疫功能，還可以通過誘導(dǎo)SBP-1的表達起到抗腫瘤作用，其與環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥時作用更顯著，抗腫瘤效果更明顯。

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