從檢驗學角度探討人體皮膚菌群

麗敏 宋佳春 王虎明

摘要：皮膚是一個復雜的微生態(tài)系統，正常情況下，細菌群落的種類和數量存在動態(tài)平衡，菌群之間的相互抑制及促進作用維持著皮膚的正常狀態(tài)。受內外界因素的影響，皮膚屏障功能受到破壞，表現為炎癥、感染等皮膚問題時，會導致皮膚正常菌群的失調、多樣性改變和致病菌的生長繁殖。本文介紹幾種獲得皮膚菌群的檢測手段，探討皮膚菌群之間的作用機制及影響菌群分布的影響因素，對常見皮膚問題（濕疹、痤瘡）中皮膚菌群的變化進行綜述。從多個方面了解皮膚菌群以及微生物在健康人及皮膚疾病中的重要組成及地位，利用皮膚常駐菌與致病菌之間的相互關系及作用機理抑制致病菌的生長，從而為微生態(tài)治療提供依據及用藥指導。

關鍵詞：皮膚細菌;檢測方法;菌群平衡;微生態(tài)治療

中圖分類號：R378? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.018

文章編號：1006-1959（2019）01-0053-03

Exploring Human Skin Flora from the Perspective of Testing

LI Min1，SONG Jia-chun2，WANG Hu-ming1

（1.Department of Clinical Laboratory，Baotou Cancer Hospital，Baotou 014030，Inner Mongolia，China;

2.Department of Clinical Laboratory，the Fourth Hospital of Baotou，Baotou 014030，Inner Mongolia，China）

Abstract：The skin is a complex micro-ecological system. Under normal circumstances， there is a dynamic balance between the types and numbers of bacterial communities， and the mutual inhibition and promotion between the bacteria maintains the normal state of the skin. Under the influence of internal and external factors， the skin barrier function is destroyed， which is manifested as skin problems such as inflammation and infection， which may lead to the imbalance of the normal flora of the skin， the change of diversity and the growth and reproduction of pathogenic bacteria. This paper introduces several methods for obtaining skin flora， discusses the mechanism of action between skin flora and the influencing factors affecting the distribution of bacteria， and reviews the changes of skin flora in common skin problems （eczema， acne）. Understand the important composition and status of skin flora and microorganisms in healthy people and skin diseases from various aspects， and use the mutual relationship between skin resident bacteria and pathogenic bacteria to inhibit the growth of pathogenic bacteria， thus Ecological treatment provides the basis and medication guidance.

Key words：Skin bacteria;Detection method;Flora balance;Microecological treatment

皮膚是人體最大的器官，作為主要的屏障系統，起著非常重要的隔離、保護作用。皮膚表面及與外界相通的腔道中存在數量龐大的細菌，皮膚一方面通過物理屏障作用阻止微生物的入侵，另一方面發(fā)揮著固有免疫和適應性免疫的免疫屏障作用[1]，是人體重要的一道保護防線。在長期的相互適應環(huán)境中，細菌對人體造成的“威脅”鑄就了其復雜的免疫力?？梢姡＞菏侨梭w健康所必須的[2]。人類皮膚表面不同細菌之間存在抑制與促進的關系，這種抑制與促進的關系表現為細菌數量與種類存在一定程度的動態(tài)平衡[3]。當平衡遭到破壞，將導致皮膚屏障功能的破壞，產生皮膚問題，因此皮膚微生態(tài)菌群的研究已經成為皮膚疾病診斷、治療中的熱點問題。2007年，人類微生物組計劃在美國國立衛(wèi)生院（NIH）的帶領下正式啟動，通過高通量測序技術對人體皮膚、鼻腔、口腔、腸道和陰道5個不同部位的微生物群落進行分析，目的是應用這一技術全面了解人體微生物群落的特點[4]。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，特別是高通量DNA測序技術的進步，人們對人體微生物菌群的研究更加深入、全面。目前，皮膚檢測手段發(fā)展到這一階段經歷了快速的技術變革，現將較常用的檢測手段以及所獲得的皮膚菌群知識綜述如下。

1皮膚微生物檢測技術

微生物檢測技術是獲得微生物特征信息的手段，從傳統的培養(yǎng)技術到最新的高通量測序平臺的建立，實現了對細菌有限數量到細菌微環(huán)境的檢測。細菌檢測方法正得到不斷的發(fā)展和更新，以往因技術欠缺所導致微觀領域認識不足等問題得到改觀。檢測方法的選擇要根據檢測目的、原理、成本及操作等多方面條件考慮進行選擇。

1.1傳統醫(yī)學實驗室檢測? 以往的醫(yī)學臨床實驗室細菌檢測多采用培養(yǎng)學方法，即用人工方法將采集的標本接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基上，提供細菌生長所必須的外界條件：適宜溫度、濕度、氣體環(huán)境等，符合特定條件的細菌則能生長繁殖。該方法檢測成本低，檢測周期較長，一些生長條件要求苛刻的細菌很難在常規(guī)條件下培養(yǎng)出來。有報道稱，皮膚上近99%的細菌是不能在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)出來的[5]。這類培養(yǎng)的鑒定過程是通過細菌形態(tài)和生化反應等表型鑒定方法進行的，相比于分子生物學方法，后者的鑒定結果更為可靠。

1.2 DNA測序技術? 在原核微生物中，16S rRNA基因是編碼16 rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌的基因組中，在結構和功能上16S rRNA具有高度的保守性和特異性，還具有“種”間多態(tài)區(qū)[6]，因此，分析其序列可確定各種細菌的進化距離和相互關系。目前，已有上千種細菌的16S rDNA序列被測定，并載入基因庫。測序技術能夠克服傳統鑒定過程中生化反應的多種局限性，對疑難細菌的鑒定尤為重要。測序技術目前已經發(fā)展到第二代，又稱新一代測序技術，相比于第一代的優(yōu)點是能夠快速、低成本地處理幾百萬基因序列信息，這種單次運行處理海量序列數據的能力是它的突出特點，故又稱為高通量測序技術[7]。目前使用最為廣泛的3種主流測序技術有Roche/454焦磷酸測序儀、Genome Analyzer（Illumina GA）測序儀和Biosystems SOLiD基因測序儀，在基因組學中具有里程碑意義。

1.3質譜技術? 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術（MALDI-TOF-MS）是將樣品（細菌、真菌）混入基質分子中使其形成晶體。當用激光照射晶體時，基質從激光中吸收能量，基質-樣品之間發(fā)生電荷轉移使得樣品分子電離，樣品電離后在電場作用下飛過真空的飛行管，通過離子的質量電荷之比（M/Z）與離子的飛行時間成正比來分析離子，并測得樣品分子的分子量。離子質量電荷之比（M/Z）為橫坐標，飛行時間檢測器探測到的離子峰為縱坐標，繪制質譜圖，經軟件與質譜數據庫進行比較，根據特異圖譜實現對目標微生物屬、種及亞型的區(qū)分和鑒定[8]。該技術可將完整病原菌細胞直接檢測，但是為降低細菌樣本復雜性，需要對檢測樣本進行增殖或富集處理。該方法鑒定過程僅用10 min甚至更短時間，耗材成本較傳統鑒定法低3～5倍[9]。菌庫大，對常規(guī)條件下難鑒定的細菌有較好的鑒定效果。

2正常皮膚菌群

人類皮膚細菌可分為兩大類：①常居菌（Resident microorganisms）：也稱固有性細菌，是人體表面數量及種類較固定的微生物群體。在皮膚環(huán)境變化菌群受到干擾的情況下，能夠重新建立原有菌群構成。Grice EA等從健康成人20個不同皮膚位置進行采樣，采取高通量測序手段發(fā)現常居菌主要分為四門：放線菌門（52%）、厚壁菌門（24%）、變形菌門（17%）和擬桿菌門（7%）[10]。主要包括：表皮葡萄球菌、需氧性孢子菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、糠秕孢子菌屬、類白喉桿菌屬等。②暫居菌（Transient microorganisms）：來自于外部環(huán)境，寄居在皮膚表面幾個小時到幾天后消失，不建立永久定植，這類細菌有革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、八疊球菌、鏈球菌屬等，還包括變形桿菌及腸桿菌科大腸桿菌及糞產檢桿菌等。宿主正常的衛(wèi)生狀況、免疫狀態(tài)、完好的皮膚屏障功能等正常狀態(tài)下，常居菌和暫居菌是不會致病的。然而，多重因素影響宿主的正常狀態(tài)時，這兩類細菌都有可能成為致病菌，增殖并引發(fā)疾病的發(fā)生。例如，表皮葡萄球菌是皮膚常居菌，在免疫力低下的患者中可能引發(fā)機會性致病。此外，一般情況下，金黃色葡萄球菌為暫居菌，在部分人群中金葡菌可成為無癥狀帶菌者的常駐微生物，同時也是重要的病原體[11]。

3影響皮膚菌群分布的因素

皮膚構造的影響及分泌的化學物質不同，導致不同個體皮膚微環(huán)境存在差異，這是皮膚菌群分布的主要影響因素。皮膚的解剖構造，如皮溝、皮嵴等為細菌提供了一個獨特的微生態(tài)棲息場所。皮脂腺、汗腺、毛囊等皮膚附屬結構的特殊凹陷及功能為細菌生長提供不同的物質及環(huán)境條件。人類皮膚根據性質不同，分為皮脂溢出部位、潮濕部位和干燥部位，這是影響皮膚菌群的一類重要因素。高通量測序顯示不同性質皮膚表面細菌分布的種類差異很大，如正常人潮濕部位多定植革蘭氏陽性的葡萄球菌、微球菌、棒狀桿菌、丙酸桿菌等[12]。皮脂分泌旺盛部位為適合厭氧環(huán)境的親脂性丙酸桿菌和親脂性真菌馬拉色菌占優(yōu)勢[13]。干燥部位定植的細菌較為豐富，以葡萄球菌、丙酸桿菌、微球菌、棒狀桿菌、鏈球菌多見[14]。另外，影響皮膚菌群分布的其他因素有：地理因素導致的紫外線差異、氣候、氣溫，過量飲酒導致營養(yǎng)和維生素缺乏降低機體免疫力和皮膚屏障功能，個人衛(wèi)生習慣和護膚品的選擇以及同一個體不同pH值及溫度等[15]。

細菌與細菌之間存在復雜的抑制、促進的關系，這種關系在菌群多樣性的產生和維持中發(fā)揮著重要的作用。抑制是通過競爭及拮抗作用來實現。微生物拮抗作用是指一種微生物在其生命活動中，產生某種代謝產物或改變環(huán)境條件，從而抑制其它微生物的生長繁殖，甚至殺死其它微生物的現象。常駐菌群能夠降低皮膚酸堿度，維持皮膚酸性環(huán)境為pH 3～5，以此抑制病原微生物的入侵和繁殖[5]，如痤瘡丙酸桿菌在某種程度上通過分解皮脂脂質釋放脂肪酸，脂肪酸所產生的酸性環(huán)境不利于金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌的繁殖，還能抑制耐甲氧西球菌和棒狀桿菌的生長，一定程度上抑制了致病菌的生長。表皮葡萄球菌則通過引起脂質膜滲漏和促進宿主產生抗菌肽（AMPs）等機制抑制致病菌的生長[16]。丙酸桿菌和表葡作為正常菌群共同對致病菌起到抑制作用，在一定程度上控制了致病菌數量，這兩種正常菌之間為促進關系。

4常見皮膚問題中菌群變化

目前，對濕疹、痤瘡患者與正常人對比研究發(fā)現細菌分布構成有所改變。濕疹是由多種內外因素引發(fā)，以瘙癢為特征的皮膚炎癥反應，易反復、難治愈，是一種常見的皮膚疾病。王華等研究表明[17]，濕疹患者的皮損部位金黃色葡萄球菌和馬拉色菌的定植率顯著高于正常人，并且與濕疹的滲出性炎癥的嚴重程度呈正相關。使用抗菌藥物針對性控制病原菌感染的種類和數量，能明顯消除濕疹患者的炎癥反應，調節(jié)細菌種類在改善濕疹癥狀及治療效果中有較好的作用。痤瘡（俗稱青春痘）是最常見的皮膚病，是毛囊、皮脂腺的炎癥性疾病，在青少年中有85%的發(fā)病率。目前普遍認為這類皮膚問題與痤瘡丙酸桿菌存在密切關系。正常條件下，常駐菌痤瘡丙酸桿菌有助于皮膚健康狀態(tài)的維持，這類菌通過分解皮膚脂質產生游離脂肪酸，維持了皮膚酸性pH，抑制了致病菌的繁殖。當雄激素上升時，皮脂腺分泌旺盛，痤瘡丙酸桿菌過度增殖，通過分泌脂酶、蛋白酶、透明質酸酶等分子導致毛囊、皮脂腺組織破裂，誘發(fā)產生促炎性細胞因子和中性粒細胞趨化因子，激活經典途徑和補體旁路替代途徑，導致炎癥的發(fā)生[18]，此時，對皮膚健康起到關鍵作用的痤瘡桿菌由于菌群結構的變化引發(fā)炎癥反應，導致條件致病。

5展望

隨著微生物檢測技術的發(fā)展，人們對皮膚菌群研究得到更加深入的認識。皮膚表面菌群數量及多樣性有助于皮膚病的診斷和治療。目前，微生物受內外界影響的因素得到不斷地揭示，作用機制了解還不夠全面，有待于進一步的研究。正常與異常皮膚菌群構成做分析、對比，這一關系可以指導臨床應用，一種是對病原菌進行針對性治療，使用抗生素抑制致病菌生長繁殖。另一種是在感染部位人為加入微生物制劑（益生菌）限制致病菌的繁殖，減少致病菌對機體的進一步侵害，這種治療方法為目前較為熱門的微生態(tài)療法[19]。微生態(tài)療法能夠改變皮膚菌群，促進正常菌群的恢復，對宿主產生有益的治療效果，能夠開發(fā)局部皮膚益生菌藥劑，幫助恢復皮膚屏障是今后皮膚微生物研究的主要方向。

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