Ⅱ級(jí)生物安全柜“三個(gè)保護(hù)”現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)方法探究

王會(huì)如 王霖 戰(zhàn)玢 北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 （北京 101111）

內(nèi)容提要： 為保證使用人員、實(shí)驗(yàn)樣品及環(huán)境不被污染，在進(jìn)一步驗(yàn)證安全柜的生物防護(hù)性能的同時(shí)，探究出更適用于現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法。通過微生物法和碘化鉀法的對(duì)比研究，針對(duì)產(chǎn)品和交叉污染保護(hù)的碘化鉀實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行探究。

近年來，SARS、H5N1、H7N9等傳染性極高的呼吸道流行性疾病的相繼出現(xiàn)極大地威脅了人類的生命安全。Ⅱ級(jí)生物安全柜（以下簡(jiǎn)稱安全柜）作為實(shí)驗(yàn)室中常用的一級(jí)防護(hù)屏障，承接許多高風(fēng)險(xiǎn)、高危害、高致病性的實(shí)驗(yàn)任務(wù)，被大量地運(yùn)用于醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)、疾病預(yù)防與控制機(jī)構(gòu)、研究院和相關(guān)醫(yī)療科研單位。因多數(shù)使用單位實(shí)驗(yàn)條件惡劣，實(shí)驗(yàn)對(duì)人員的風(fēng)險(xiǎn)，樣品易污染等原因，安全柜的物理性能檢測(cè)已滿足不了使用單位要求，更多單位提出需要進(jìn)行人員、產(chǎn)品和交叉污染保護(hù)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.微生物法與碘化鉀法的概述

微生物法是將已經(jīng)配制完成的不同濃度枯草芽孢桿菌菌液以噴霧器主動(dòng)釋放，由碰撞采樣器和狹縫采樣器進(jìn)行收集，磷酸鹽緩沖液和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿充當(dāng)載體的方式，對(duì)安全柜人員、產(chǎn)品和交叉污染保護(hù)進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法。作為0569-2011的仲裁檢驗(yàn)方法以及NSF49中唯一承認(rèn)的檢驗(yàn)方法，微生物法科學(xué)、準(zhǔn)確、有效。碘化鉀法是通過上游釋放碘化鉀微粒氣溶膠，下游經(jīng)空氣采樣器進(jìn)行采樣，采樣器內(nèi)置錐形頭及過濾膜，錐形頭用以使空氣與碘化鉀微粒分離后落在濾膜上。

采樣結(jié)束后將濾膜浸入氯化鈀試劑中，最后通過放大鏡觀察過濾膜上被捕捉到的碘化鉀微粒數(shù)來計(jì)算“保護(hù)因子值”。

微生物法和碘化鉀法的實(shí)驗(yàn)原理不盡相同，但又各具利弊。微生物法作為一直沿用的實(shí)驗(yàn)方法，能夠更加全面的驗(yàn)證安全柜的“三個(gè)保護(hù)”性能，但此種方法對(duì)于實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)周期、實(shí)驗(yàn)操作性以及實(shí)驗(yàn)廢棄物的后期處理要求嚴(yán)格。碘化鉀法作為一種化學(xué)檢驗(yàn)方法，受外界環(huán)境干擾較小，便捷有效，并能夠短時(shí)間呈現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但目前此種方法只局限于檢測(cè)安全柜的人員保護(hù)，并未涉及產(chǎn)品和交叉污染保護(hù)的檢測(cè)。故通過微生物法和碘化鉀法的對(duì)比研究，針對(duì)產(chǎn)品和交叉污染保護(hù)的碘化鉀實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分析，進(jìn)而探究出更適用于現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法。

2.人員保護(hù)

2.1 微生物法

微生物法是經(jīng)上游噴霧器釋放（1×108～8×108）/mL的枯草芽孢菌芽孢，下游由撞擊式采樣器和狹縫采樣器進(jìn)行收集[1]。撞擊采樣器和狹縫采樣器中分別放置磷酸鹽緩沖液和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)磷酸鹽緩沖液進(jìn)行抽濾處理，并將“帶菌”濾紙和狹縫采樣器中的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿進(jìn)行微生物培養(yǎng)，48h后觀察菌落數(shù)是否符合要求，以判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖1）。

圖1.微生物現(xiàn)場(chǎng)操作

人員保護(hù)（微生物法）判斷標(biāo)準(zhǔn)：全部撞擊式采樣器收集的枯草芽孢菌菌落形成單位（CFU）數(shù)量應(yīng)不超過10[1]。狹縫采樣器培養(yǎng)皿中枯草芽孢桿菌計(jì)數(shù)應(yīng)不超過5CFU，對(duì)照培養(yǎng)皿應(yīng)呈陽(yáng)性（＞300CFU）人員保護(hù)（微生物法）特點(diǎn)：噴霧器與采集器之間有隔離（安全柜氣幕及移窗），噴霧器釋放一定濃度的“菌霧”，采樣器收集“帶菌”空氣；抽濾收集的空氣并進(jìn)行48h微生物培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)用以判定結(jié)果，枯草芽孢桿菌與環(huán)境菌難以用肉眼進(jìn)行區(qū)分，并且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)；枯草芽孢菌不易滅活，易生長(zhǎng)，具有極高的指示作用，但會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境造成一定程度污染（見表1）。

表1.微生物法檢測(cè)儀器

2.2 碘化鉀法

碘化鉀法是經(jīng)上游氣溶膠發(fā)生器的渦流盤和噴嘴高速噴射碘化鉀微粒氣溶膠，下游通過空氣采樣器抽氣采樣，采樣頭內(nèi)置錐形頭及過濾膜，錐形頭能夠?qū)⒈瓤諝庵氐奈⒘Ｑ刂本€通道沉積在底部的過濾膜上，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將過濾膜與氯化鈀溶液充分反應(yīng)，最后通過放大鏡觀察過濾膜上被捕捉到的碘化鉀微粒數(shù)來計(jì)算“保護(hù)因子值”是否達(dá)到要求（見圖2）。

圖2.碘化鉀法現(xiàn)場(chǎng)操作

人員保護(hù)（碘化鉀法）判定標(biāo)準(zhǔn)：用公式（1）計(jì)算釋放的KI粒子數(shù)N：

式中：V是氣溶膠發(fā)生器分散的KI溶液的體積，單位以mL表示；3.1×107是由液滴尺寸、采樣流量和渦流盤轉(zhuǎn)速導(dǎo)出的一個(gè)常數(shù)。

用公式（2）計(jì)算由每個(gè)過濾膜得到的開口保護(hù)因子值A(chǔ)pf：

式中：F是采樣流量，單位以L/min表示；n是過濾膜上的斑點(diǎn)數(shù)。

其中V=20mL，F(xiàn)=100L/min，保護(hù)系數(shù)Apf=6.2×106/n。碘化鉀法的判定標(biāo)準(zhǔn)實(shí)則計(jì)算前窗操作口的保護(hù)因子Apf≥1×105，并可推算出過濾膜上的斑點(diǎn)數(shù)不能超過62個(gè)[1]。

人員保護(hù)（碘化鉀法）特點(diǎn)：噴霧器與采集器之間有隔離（安全柜氣幕及移窗），氣溶膠發(fā)生器噴射15g/L碘化鉀乙醇溶液，空氣采樣器采樣空氣中的碘化鉀微粒；采樣結(jié)束后，過濾膜與氯化鈀溶液進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，并在去離子水中清洗，短時(shí)間呈現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；碘化鉀法對(duì)人體及環(huán)境影響較小，避免了對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的污染（見表2）。

表2.碘化鉀法檢測(cè)儀器

2.3 微生物法與碘化鉀法的對(duì)比分析

安全柜YY 0569-2011行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，人員保護(hù)可以選擇微生物法和碘化鉀法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)表3對(duì)比分析得出，人員保護(hù)的碘化鉀法和微生物法，無論從測(cè)試方法還是實(shí)驗(yàn)原理，具有等效性，可以作為在用安全柜現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的替代方法。

表3.人員保護(hù)-微生物法與碘化鉀法對(duì)比分析

3.產(chǎn)品保護(hù)

3.1 微生物法

由于安全柜產(chǎn)品保護(hù)實(shí)驗(yàn)微生物法是判斷其實(shí)驗(yàn)結(jié)果的唯一方法，所以在分析碘化鉀法是否具有可替代性之前，先要了解產(chǎn)品保護(hù)的實(shí)驗(yàn)方法、原理及特點(diǎn)。產(chǎn)品保護(hù)實(shí)驗(yàn)是為驗(yàn)證前窗氣幕對(duì)外界污染物的屏蔽作用，避免內(nèi)部實(shí)驗(yàn)樣品受到外界環(huán)境的污染（見圖3）。

圖3.產(chǎn)品保護(hù)現(xiàn)場(chǎng)操作

如圖3所示，將盛有55mL濃度為（1×106～8×106）/mL芽孢懸浮液的噴霧器放在安全柜外，噴霧器噴射軸在安全柜中心并與前窗操作口上沿平齊，噴霧器的噴嘴前端位于前窗操作口外100mm，噴霧方向平行于臺(tái)面，正對(duì)前窗操作口處進(jìn)行噴霧。柜內(nèi)放置大量的培養(yǎng)皿，用于采樣進(jìn)入到安全柜內(nèi)，并隨氣流沉降在培養(yǎng)皿上的芽孢。微生物培養(yǎng)（48h）后，觀察并計(jì)算培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，從而得到“污染”物的污染程度及數(shù)量分布情況。

產(chǎn)品保護(hù)的判定標(biāo)準(zhǔn)：用1×106～8×106枯草芽孢菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)5min后，在培養(yǎng)皿上的枯草芽孢桿菌芽孢應(yīng)不超過5CFU，對(duì)照培養(yǎng)基呈陽(yáng)性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次均符合要求[1]。

產(chǎn)品保護(hù)的特點(diǎn)：噴霧器從安全柜外釋放芽孢懸浮液，由操作臺(tái)上擺放的瓊脂培養(yǎng)皿作為載體進(jìn)行采樣，噴霧器與載體之間通過氣幕及移窗進(jìn)行物理隔離；產(chǎn)品保護(hù)是隨安全柜內(nèi)部氣流自然沉降的方式進(jìn)行采樣，不涉及撞擊采樣器、空氣采樣器等自動(dòng)采樣儀器；需經(jīng)48h微生物培養(yǎng)，方可判定結(jié)果；每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用酒精或消毒液對(duì)安全柜柜體進(jìn)行反復(fù)擦拭，避免影響下組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.2 碘化鉀法

模擬產(chǎn)品保護(hù)微生物法的實(shí)驗(yàn)原理及方法，將碘化鉀氣溶膠發(fā)生器與空氣采樣器按照微生物法的實(shí)驗(yàn)方式擺放，如下圖4～6所示，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，保護(hù)因子不小于1×105。是否能達(dá)到與微生物法相同的效果還需進(jìn)一步探究和分析。根據(jù)表4，顯然在產(chǎn)品保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，碘化鉀法與微生物法在“采樣方式”和“采樣面積”上有所不同。仔細(xì)分析卻能得出兩者之間的“等同”性。

表4.產(chǎn)品保護(hù)實(shí)驗(yàn)中碘化鉀法與微生物法對(duì)比分析

采樣方式上分析：在微生物法中，如果有“污染因子”進(jìn)入安全柜中，在安全柜氣流的作用下，通過沉降的方式落在培養(yǎng)皿中，最終在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中被“讀出”。

其測(cè)試方法是典型的懸浮粒子沉降菌測(cè)試法。碘化鉀法則是，如果有“污染因子”進(jìn)入安全柜中，被空氣采樣器“捕獲”，所采集到的微粒是“懸浮”在空氣中，其測(cè)試方式類似浮游菌測(cè)試法。

從微粒沉降的角度上看，當(dāng)其不受氣流影響時(shí)的重力、慣性力和擴(kuò)散三種作用力，自身運(yùn)行的速度和距離是很微小的；而在運(yùn)動(dòng)的氣流中，小微粒幾乎以完全相同的速度跟隨氣流運(yùn)動(dòng)（見文獻(xiàn)[2]，6-6章節(jié)，氣流支微粒運(yùn)動(dòng)的影響內(nèi)容）。假設(shè)安全柜的送風(fēng)氣流流速在0.30m/s，安全柜內(nèi)腔高度在0.65m左右，則不到3s的時(shí)間就會(huì)被臺(tái)面上的培養(yǎng)皿捕獲?？臻g中采集到的懸浮粒子基本上百分百會(huì)被氣流引導(dǎo)而“沉降”。所以“浮游”采樣一定程度可以反映“沉降”狀況。

圖4.對(duì)比實(shí)驗(yàn)操作圖

根據(jù)文獻(xiàn)[2]，9-6章節(jié)，沉降菌和浮游菌關(guān)系中論述，前蘇聯(lián)的奧梅梁斯基公式是普遍采用的換算沉降菌與浮游菌關(guān)系的公式，該公式表示，在100cm2培養(yǎng)基上沉降5min所得細(xì)菌數(shù)量，與10L空氣中的浮游含菌量相同。其中10L為校正值，用公式表示即：

式中：Ng——菌濃（個(gè)/L）；NL——在100cm2培養(yǎng)基上沉降5min后的菌落數(shù)（個(gè)）；10——校正值。

圖5.碘化鉀法布點(diǎn)位置

（3-2）式說明了浮游與沉降采樣之間關(guān)系密切，一定程度上可以換算。此公式屬于普遍性公式，通過大量實(shí)驗(yàn)比對(duì)，校正值“10”在不同條件下均要有所變化。一般規(guī)律是干凈場(chǎng)所校正值較小，一般3～5，在惡劣條件下，可能會(huì)大于30。在安全柜內(nèi)，空氣潔凈，且氣流均勻，從微粒更容易沿氣流運(yùn)行的狀態(tài)上看，其校值應(yīng)取小值。

圖6.空氣采樣器擺放位置

產(chǎn)生多個(gè)校正值的原因主要是（3-2）式所表達(dá)的沉降量一般公式是一個(gè)慣用的公式，在文獻(xiàn)[2]中提到，可以用文獻(xiàn)中（6-32）式計(jì)算校正值。

參數(shù) 名稱 參數(shù) 名稱α 沉積因素修正系數(shù) f 沉積面積ω風(fēng)速修正系數(shù) t 沉積時(shí)間β 沉降阻力修正系數(shù) υs 氣流流速密度修正系數(shù)

當(dāng)采用平皿測(cè)浮游菌時(shí)，可采用下面公式[3]：

式中：Nm——浮游菌濃度（個(gè)/m3）；C——平均每個(gè)φ90平皿菌落（個(gè)）；X——校正值，X取3；A——個(gè)沉降平皿的單位面積（cm2）；T——沉降時(shí)間（min）。

例：產(chǎn)品保護(hù)使用φ90培養(yǎng)皿50個(gè)計(jì)，菌落數(shù)為5個(gè)，則5min沉降相當(dāng)?shù)母∮尉鷿舛葹?/p>

采樣面積上分析：從（3-4）式看，在采樣面積上完全可以通過平皿的數(shù)量來進(jìn)行換算。但受到采樣器數(shù)量的影響，所采集的樣本空氣是不是能代表柜內(nèi)的“污染”情況，即涉及到采樣量的確定更有關(guān)采樣點(diǎn)的布置。這些均需要大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證。

采用碘化鉀法替代微生物法進(jìn)行產(chǎn)品保護(hù)實(shí)驗(yàn)，必須解決以下問題：①碘化鉀氣溶膠發(fā)生發(fā)“霧”量與生物噴霧器發(fā)“霧”量之間的換算。顯然在生物實(shí)驗(yàn)中采用的是106級(jí)數(shù)的“菌霧”，碘化鉀法是108級(jí)數(shù)“微粒霧”，這就勢(shì)必要調(diào)整氣溶膠發(fā)生器的參數(shù)。②結(jié)果判定時(shí)，“顯影”斑點(diǎn)與沉降菌采樣菌落數(shù)之間的關(guān)系確定。這影響至碘化鉀空氣采樣量的重新設(shè)定等因素。通過分析，采用浮游菌采樣的方法是有可能替代沉降法，但一定要解決采樣量、采樣布點(diǎn)、計(jì)算與實(shí)際值的修正等問題。那么使用碘化鉀法的替代性也變成了可能。但有些換算關(guān)系、參數(shù)設(shè)定很難推導(dǎo)的話，則必須有大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來支撐驗(yàn)證其可靠性。

4.交叉污染保護(hù)

4.1 微生物法

交叉污染保護(hù)一方面避免因安全柜操作人員的動(dòng)作干擾而引起安全柜內(nèi)樣品之間交叉污染的測(cè)試，另一方面也是防止安全柜操作區(qū)域內(nèi)左右兩側(cè)污染物進(jìn)入中央操作區(qū)，污染實(shí)驗(yàn)樣品。如圖7所示，噴霧器放置于安全柜內(nèi)緊靠側(cè)壁處進(jìn)行噴霧，柜內(nèi)距側(cè)壁360mm處放置培養(yǎng)皿作為陽(yáng)性對(duì)照，360mm處放置培養(yǎng)皿進(jìn)行采樣。通過48h微生物培養(yǎng)，計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，從而得到“污染”物的污染程度及數(shù)量分布情況。

圖7.交叉污染現(xiàn)場(chǎng)操作

表5.交叉污染實(shí)驗(yàn)中碘化鉀法與微生物法對(duì)比分析

圖8.對(duì)比實(shí)驗(yàn)操作圖

圖9.碘化鉀法布點(diǎn)位置圖

交叉污染的判定標(biāo)準(zhǔn)：用（1×104～8×104）/mL枯草芽孢菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，左右兩側(cè)距被檢側(cè)壁360mm外在培養(yǎng)皿上的枯草芽孢菌落數(shù)均應(yīng)不超過2CFU。

圖10.空氣采樣器擺放位置

4.2 碘化鉀法

模擬交叉污染保護(hù)微生物法的實(shí)驗(yàn)原理及方法，將碘化鉀氣溶膠發(fā)生器與空氣采樣器按照微生物法的實(shí)驗(yàn)方式擺放，如下圖8～10所示，左右兩側(cè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，保護(hù)因子不小于1×105。是否能達(dá)到與微生物法相同的效果還需進(jìn)一步探究和分析。

從表5看，如果按3.2分析內(nèi)容，碘化鉀法解決了“浮游”與“沉降”之間問題，完全有可能替代微生物法?？墒聦?shí)并非如此。人員保護(hù)、產(chǎn)品保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)塵單元（氣溶膠發(fā)生器、噴霧器）與采樣單元（空氣采樣頭，培養(yǎng)皿）分別位于柜內(nèi)與柜外，之間存在氣動(dòng)及物理屏障，即上游氣流的波動(dòng)對(duì)下流采樣結(jié)果基本沒有影響。根據(jù)本文3.2內(nèi)容中關(guān)于微粒由“浮游”到“沉降”狀態(tài)的分析中，微粒更易受到影響而隨氣流運(yùn)動(dòng)，在沒有氣流干擾的情況上，“浮游”微粒會(huì)順利“沉降”。然而在交叉污染實(shí)驗(yàn)中，由于發(fā)“霧”與采樣均處于同一區(qū)域，且距離較近，采樣的抽吸作用會(huì)直接影響下降氣流的流型，當(dāng)下降氣流流型被破壞，就直接破壞了“沉降”的可信度?？諝獠蓸託獾摹爸鲃?dòng)”抽氣，會(huì)使氣溶膠發(fā)生器發(fā)出的高濃度微粒被誘導(dǎo)抽入，便很難判定結(jié)果的真實(shí)有效性。

5.小結(jié)

為了尋求一種更為便捷、精準(zhǔn)、科學(xué)的安全柜“三個(gè)保護(hù)”現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)方法，分別對(duì)微生物法與碘化鉀法進(jìn)行論述，再將兩種方法進(jìn)行對(duì)比分析。碘化鉀法在人員保護(hù)實(shí)驗(yàn)中有著實(shí)驗(yàn)操作方便，短時(shí)間呈現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)外界環(huán)境影響小的優(yōu)點(diǎn)?；谒膬?yōu)點(diǎn)，對(duì)碘化鉀法在產(chǎn)品保護(hù)與交叉污染保護(hù)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用性進(jìn)行了探索性分析。在產(chǎn)品保護(hù)方面是有可能發(fā)揮其特長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。但交叉污染保護(hù)實(shí)驗(yàn)的可行性存在很大的問題，還需進(jìn)一步探究。