活血降脂膠囊對(duì)高脂血癥大鼠血脂和脂肪肝調(diào)脂的機(jī)制研究

， ， ，小軍

心腦血管病是危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，其以高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致腦血管疾病的重要原因，而血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化最重要的危險(xiǎn)因素之一，積極調(diào)節(jié)血脂可減輕動(dòng)脈粥樣硬化的程度，最終達(dá)到減少心腦血管疾病的發(fā)生率、復(fù)發(fā)率及死亡率的目的，減輕病人的思想及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提高生活質(zhì)量。目前很多調(diào)脂藥物的不良反應(yīng)限制了它們?cè)谂R床的應(yīng)用?；钛抵z囊為山西省中醫(yī)院中藥復(fù)方制劑，應(yīng)用20年來(lái)，臨床效果好，不良反應(yīng)小。本研究觀察活血降脂膠囊對(duì)血脂水平的影響，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 高脂飼料 北京華阜康生物科技股份有限公司提供，主要成分：78.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油和0.2%的膽鹽，批號(hào)：11003800007181，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0008。

1.2 主要藥物與試劑 活血降脂膠囊，由山西省中醫(yī)藥研究院制劑室提供；辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司)，規(guī)格：20 mg，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20130068；正常兔血清封閉液，武漢博士德生物工程有限公司；山羊IgG，武漢博士德生物工程有限公司；生物素化兔抗山羊IgG，武漢博士德生物工程有限公司；SABC免疫組化染色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色試劑盒武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑包括：粘片劑APES(武漢博士德生物工程有限公司)；30%H2O2；蒸餾水；0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)；免疫組化專(zhuān)用PBS(pH7.2～7.6)；蒸餾水、10%水合氯醛、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒：南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要儀器 賽默飛世爾(上海)FINNPIPETTE微量移液器；上海安泰分析儀器有限公司AT-858型自動(dòng)酶標(biāo)分析儀；科大創(chuàng)新股份有限公司KDC-2046低速冷凍離心機(jī)；北京中興偉業(yè)儀器有限公司DZKW-4恒溫水浴箱；石蠟包埋機(jī)：Histocentre 3，英國(guó)Shandon；石蠟切片機(jī)：Finesse 325，英國(guó)Shandon；全自動(dòng)組織脫水機(jī)：Excelsior，英國(guó)Shandon；熒光顯微成像系統(tǒng)：BX53，日本Olympus公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠雄性雌性共57只，鼠齡40～45 d，體重100 ～120 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，清潔級(jí)，合格證號(hào)：11401300033000，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物飼養(yǎng) 動(dòng)物購(gòu)入后在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)普通飼料1周，不限飲水、飲食。

1.5.2 動(dòng)物分組及給藥方法、劑量 將57只大鼠，隨機(jī)抽取空白組(A組)12只，給予普通飼料喂養(yǎng)，其余45只飼高脂飼料制備大鼠高脂血癥模型，2月后隨機(jī)抽取空白組10只，模型組10只，禁食不禁水12 h，股動(dòng)脈取血，測(cè)TC、TG、LDL-C、HDL-C，測(cè)得模型組TC、TG、LDL-C較空白組高，HDL-C降低或無(wú)變化，提示造模成功。

造模成功后，將模型組45只大鼠隨機(jī)分為3組，高脂模型組(B組)、辛伐他汀片組(C組)、活血降脂膠囊組(D組)。造模成功后，57只大鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)，各組均按10 mL/kg體重灌胃，空白組和高脂模型組蒸餾水灌胃，給藥組給藥，C組0.83 mg/kg、D組1.5 g/kg，連續(xù)給藥30 d，每7天稱(chēng)體重1次，根據(jù)體重調(diào)整藥量。

1.5.3 觀察指標(biāo)與方法 實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后，10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心機(jī)離心，取血清，用血脂四項(xiàng)試劑盒測(cè)定TC、TG、LDL-C、HDL-C。取肝臟組織，經(jīng)制片、脫水、切片、染色、封片等步驟后，在光鏡下觀察病理改變。另取肝臟組織，免疫組化采用石蠟切片熱修復(fù)抗原程序。①采用APES載玻片防脫片劑處理；②切片常規(guī)脫蠟至水；③30%H2O21份+蒸餾水10份混合，室溫10 min滅活內(nèi)源性酶；④將切片浸入0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐加熱沸騰，間隔5 min反復(fù)1次，冷卻后PBS洗滌2次；⑤滴加封閉液，室溫20 min；⑥滴加山羊IgG，4 ℃過(guò)夜；⑦加生物素化兔抗山羊IgG，37 ℃20 min，PBS洗2 min×3次；⑧滴加試劑SABC，37 ℃20 min，PBS洗5 min×4次；⑨使用DAB顯色試劑盒顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間；⑩蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 給藥前模型組與各組間血脂指標(biāo)比較 給藥前，與空白組相比，模型組TC、TG、LDL-C均增高，HDL-C下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，提示造模成功。詳見(jiàn)表1。

2.2 給藥后各組間血脂指標(biāo)比較 給藥后，與高脂模型組相比，辛伐他汀片組及活血降脂膠囊組TC、TG、LDL-C均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HDL-C增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明活血降脂膠囊可有效改善大鼠血脂水平。辛伐他汀片組與活血降脂膠囊組相比，血脂水平差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩組用藥調(diào)節(jié)血脂療效接近，但活血降脂膠囊血脂水平更低一些，提示活血降脂膠囊可能療效更好。詳見(jiàn)表1。

表1 給藥后各組間血脂指標(biāo)比較(±s) mmol/L

與空白組比較，1)P<0.05，與高脂模型組比較，2)P<0.05

2.3 肝臟病理改變結(jié)果 空白組未見(jiàn)異常。高脂模型組多處見(jiàn)肝小靜脈周?chē)匝准?xì)胞散在浸潤(rùn)；多處灶狀肝細(xì)胞壞死后炎細(xì)胞浸潤(rùn)；全肝細(xì)胞脂肪變性。辛伐他汀組少部分肝細(xì)胞脂肪變性?；钛抵z囊組少部分肝細(xì)胞脂肪變性。詳見(jiàn)圖1。

圖1肝臟病理圖

2.4 肝臟載脂蛋白表達(dá)結(jié)果 空白組載脂蛋白A表達(dá)最強(qiáng)，與空白組相比，模型組載脂蛋白A表達(dá)明顯減弱，給藥組與模型組相比，載脂蛋白A表達(dá)均增強(qiáng)，提示活血降脂膠囊能使高脂血癥大鼠的載脂蛋白A表達(dá)增強(qiáng)。而各組載脂蛋白B表達(dá)未見(jiàn)明顯不同，提示各組對(duì)載脂蛋白B表達(dá)改變影響不明顯。詳見(jiàn)表2、圖2、圖3。

表2 肝臟載脂蛋白表達(dá)表

注：-陰性，+ 淺黃色，++ 黃色，+++棕黃色

圖2 肝臟載脂蛋白A表達(dá)

圖3 肝臟載脂蛋白B表達(dá)

3 討 論

血脂包括TG、TC和類(lèi)脂，與臨床相關(guān)的主要血脂成分為T(mén)G、TC，血脂需要與載脂蛋白結(jié)合形成脂蛋白存在于血液中，人體主要脂蛋白包括HDL-C、LDL-C，LDL-C是含有膽固醇最多的脂蛋白，其中主要載脂蛋白為ApoB100，HDL-C中主要載脂蛋白為Apo A1，高脂血癥的形成主要與TC、TG、LDL-C密切相關(guān)，其中LDL-C是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素，HDL-C可將血清膽固醇轉(zhuǎn)移至肝臟從而起到降血脂的作用。

活血降脂膠囊作為山西省中醫(yī)院制劑，在多年臨床應(yīng)用中取得較好療效，可以調(diào)節(jié)血脂，改善脂肪肝及動(dòng)脈粥樣硬化，活血降脂膠囊主要成分包括：山楂、澤瀉、丹參、黃芪、茵陳、決明子、川芎。山楂中具有調(diào)脂作用的物質(zhì)包括總黃酮、三萜酸等，通過(guò)多種途徑來(lái)調(diào)節(jié)血脂，如：增加低密度脂蛋白受體水平，提高膽固醇7α-羥化酶的表達(dá)水平，抑制?；o酶A活性，抑制3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶等，具有明確的調(diào)脂作用[1]。澤瀉能通過(guò)升高HDL-C，降低LDL-C達(dá)到調(diào)節(jié)血脂，防治動(dòng)脈粥樣硬化及脂肪肝的作用[2]。丹參能降低TC、LDL-C達(dá)到調(diào)脂作用[3]。黃芪[4]、茵陳[5]、決明子[6]也具有明確的降脂作用。川芎沒(méi)有明確的調(diào)脂作用，但對(duì)血管有明確的保護(hù)作用，能夠抗炎、抗血小板聚集、改善動(dòng)脈粥樣硬化等[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，活血降脂膠囊可以降低高脂血癥大鼠TG、TC、LDL-C水平，且療效與辛伐他汀片相比，可能有一定優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明活血降脂膠囊調(diào)節(jié)血脂的有效性。

非酒精性脂肪性肝病病理改變以肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥變化為特征[8]。有研究顯示活血降脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝有明確的治療作用[9]。本實(shí)驗(yàn)中高脂模型組全肝脂肪變性，并出現(xiàn)部分肝細(xì)胞壞死和多處炎細(xì)胞浸潤(rùn)，證明了造模成功，活血降脂膠囊可以有效改善非酒精性脂肪肝的脂肪變性，對(duì)脂肪肝有明確的保護(hù)作用。

血清載脂蛋白是血清脂蛋白中的蛋白質(zhì)成分，包括A、B、C、D、E五類(lèi)，與臨床相關(guān)的主要是載脂蛋白A和載脂蛋白B。載脂蛋白A可分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型，統(tǒng)稱(chēng)為載脂蛋白A，載脂蛋白A是HDL-C的主要載脂蛋白，體現(xiàn)了HDL-C的功能，與動(dòng)脈粥樣硬化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。載脂蛋白B是LDL-C的主要成分，體現(xiàn)了LDL-C的功能，與動(dòng)脈粥樣硬化成正相關(guān)。載脂蛋白主要在肝臟合成，肝臟載脂蛋白的表達(dá)可以體現(xiàn)人體脂質(zhì)代謝的能力。本實(shí)驗(yàn)中，高脂模型組肝臟載脂蛋白A表達(dá)明顯下降，活血降脂膠囊各組均能使載脂蛋白A表達(dá)升高，體現(xiàn)了活血降脂膠囊有可能是通過(guò)提高肝臟載脂蛋白A表達(dá)而達(dá)到調(diào)節(jié)血脂的作用。各組肝臟載脂蛋白B表達(dá)未見(jiàn)有意義的不同，尚不能排除無(wú)關(guān)性，有必要進(jìn)一步研究。

此實(shí)驗(yàn)肯定了活血降脂膠囊的降脂效果，其調(diào)脂機(jī)制可能為提高肝臟載脂蛋白A的表達(dá)，進(jìn)而影響血清血脂水平，并且能夠?qū)χ靖斡忻鞔_的治療作用，且此藥副作用較小。但其具體降脂機(jī)制尚不明確，可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究，并將大鼠處死選取肝臟組織和主動(dòng)脈，觀察血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9) 在主動(dòng)脈的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討中藥復(fù)方制劑活血降脂膠囊對(duì)干預(yù)大鼠炎癥介質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞因子及穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的相關(guān)性，探索活血降脂膠囊在穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用機(jī)制，為活血降脂膠囊的臨床應(yīng)用提供更為堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。