紅景天苷對急性腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損評分與腦含水量的影響及其作用機制研究

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腦出血(ICH)是一種發(fā)病急，病情危重的疾病，其致殘率和致死率非常高，嚴重影響人類的健康和生存質(zhì)量。腦出血后再血腫形成過程中以及形成后，均存在水腫和炎癥反應(yīng)，對腦組織造成了進一步的損傷[1]。目前腦出血治療缺乏有效手段，臨床上主要采用降顱壓、神經(jīng)營養(yǎng)藥物或者手術(shù)清除血腫等方式，但是由于腦出血后血腫周圍組織損傷機制尚未清晰，所以尚未有特異的治療方法。

紅景天苷是中藥紅景天中最重要的有效成分之一。近年來人們對紅景天進行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)其具有多種藥理作用，如抗疲勞，防癌，促進血液循環(huán)，清除體內(nèi)毒素等[2]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能夠增加缺血腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)的含量，加速清除超氧陰離子自由基，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量，具有減輕缺血腦組織乳酸中毒的作用[3]。本研究通過建立腦出血大鼠模型，研究紅景天苷對腦出血大鼠腦組織是否具有保護作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠75只，雄性，SPF級，體重230～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于恒溫恒濕環(huán)境中，常規(guī)飼料，自由飲水進食，晝夜各12 h，進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實驗試劑 紅景天苷(Salidroside)購自上海晶都生物技術(shù)有限公司；髓過氧化物酶(MPO)活性測定試劑盒購自Sigma-Aldrich公司；缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體購自Santa cruz公司；β-actin抗體購自碧云天技術(shù)公司。

1.3 實驗分組 按隨機數(shù)字表法將大鼠分為5組，每組15只。假手術(shù)組(Sham)、腦出血組(ICH)、藥物低劑量組(Sal-L)、藥物中劑量組(Sal-M)和藥物高劑量組(Sal-H)。建立腦出血大鼠模型成功后，藥物低劑量組、藥物中劑量組和藥物高劑量組分別給予紅景天苷灌胃10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg，每日1次，共給藥10 d，假手術(shù)組與腦出血組分別給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，共給予10 d。

1.4 腦出血大鼠模型建立 所有大鼠術(shù)前12 h禁食，6 h禁水，腹腔注射1%氯胺酮(30 mg/kg)進行麻醉，俯臥固定在立體定位儀上，大鼠前囟點與人字點在同一水平面，暴露顱骨，以前囟為原點，往后0.2 mm，左3 mm為穿刺點，牙科鉆垂直鉆穿顱骨，用微量進樣針吸取2.5 μL Ⅶ型膠原酶，從鉆孔點進針，深度約為6 mm，緩緩注入后，留針約5 min，推針，縫合。假手術(shù)組除不注射Ⅶ型膠原酶，其他操作同上。

1.5 神經(jīng)功能缺損評分 建模成功的評分標準參照Longa方法[4]，分為5級：正?；顒樱瑹o神經(jīng)功能缺損記0分；癱瘓側(cè)前肢不能充分伸展計1分；大鼠有向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)的行為計2分；向癱瘓側(cè)傾倒計3分；無法自發(fā)行走，意識喪失計4分；對麻醉清醒后的大鼠進行神經(jīng)功能評分。1～3分為造模成功，0、4分為造模不成功。

1.6 腦含水量 給藥結(jié)束后，戊巴比妥腹腔注射過量麻醉，斷頭，快速取腦，去除嗅球、小腦、腦干和軟腦膜后，迅速稱量濕重，在95～100 ℃烤箱烘烤24 h至恒重，稱量干重，計算腦組織腦含水量。

1.7 MPO活性測定 給藥結(jié)束后，過量麻醉，斷頭，快速取腦組織，勻漿，取上清液，嚴格按照MPO試劑盒說明書要求，在25 ℃分光光度計460 nm波長處測定MPO活性，即每分鐘降解1 μmoL時所需要過氧化物的量。

1.8 免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白表達 末次給藥后，過量麻醉處死大鼠，剪取大鼠血腫周圍腦組織，加入裂解液于冰上裂解30 min，12 000 r/min，4 ℃離心5 min，收集細胞，提取細胞總蛋白并定量，調(diào)整蛋白量。取等量裂解產(chǎn)物，上樣，進行12%SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫放置1 h，將膜于一抗中孵育4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；加入對應(yīng)二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，運用Image J圖像分析系統(tǒng)對每個條帶進行灰度分析。

1.9 實時熒光定量PCR 獲得大鼠血腫周圍腦組織后，勻漿，嚴格按照說明書操作，加入1 mL Trizol試劑，室溫放置5 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，以cDNA為模板在聚合酶催化下進行PCR反應(yīng)，HIF-1α引物：上游5′-CTTTCTTGGAAACGAGTGAAAGG-3′，下游5′-TGAGTAATTCTTCACCCTGCAG-3′；VEGF引物：上游5′- ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG -3′，下游5′- TCACCG CCTCGGCTTGTCACA -3′；GADPH引物：上游5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。94 ℃ 43 s， 61 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，共34個循環(huán)，實驗結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中進行分析對比，目標基因的相對定量用2-△△CT計算。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分 造模完成后，僅腦出血組出現(xiàn)2只大鼠死亡，已補充。腦出血組與給藥組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；紅景天苷各劑量組神經(jīng)功能缺損評分低于腦出血組(P<0.05)，但高于假手術(shù)組。詳見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較(±s) 分

與Sham組比較，1)P<0.05；與ICH組比較，2)P<0.05

2.2 各組大鼠腦含水量的變化 腦出血組大鼠腦含水量(85.25±0.68)%明顯高于假手術(shù)組的(73.82±0.49)%；給予紅景天苷處理后的大鼠腦含水量明顯低于腦出血組大鼠(P<0.05)，藥物低劑量組大鼠為(81.77±0.72)%，藥物中劑量組大鼠為(78.29±0.68)%，藥物高劑量組為(75.97±0.51)%，隨藥物劑量增大腦含水量逐漸下降。

2.3 各組大鼠腦組織中MPO活性變化 腦出血組與給藥組大鼠腦組織中的MPO活性在給藥5 d后達到峰值，隨時間延長而略有下降，紅景天苷處理后的大鼠腦組織中MPO活性顯著低于腦出血組(P<0.05)，并隨藥物劑量增大，而MPO活性降低。詳見表2。

表2 各組大鼠腦組織中MPO活性比較(±s) U/g

與Sham組比較，1)P<0.05；與ICH組比較，2)P<0.05

2.4 腦血腫周圍組織HIF-1α和VEGF的蛋白表達 腦出血組大鼠腦血腫組織的HIF-1α和VEGF的蛋白表達明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，采用紅景天苷干預(yù)后的HIF-1α和VEGF的蛋白表達顯著高于腦出血組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，并隨藥物劑量增加而表達上調(diào)。詳見圖1。

與Sham組相比，*P<0.05；與ICH組相比，#P<0.05

2.5 腦血腫周圍組織HIF-1α和VEGF的mRNA表達 腦出血組大鼠腦腫組織的HIF-1α和VEGF的mRNA表達明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，采用紅景天苷干預(yù)后的HIF-1α和VEGF的mRNA表達明顯高于腦出血組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。詳見圖2。

與Sham組相比，*P<0.05；與ICH組相比，#P<0.05

3 討 論

本實驗通過注射Ⅶ型膠原酶成功建立腦出血大鼠模型，采用給予不同劑量的紅景天苷，發(fā)現(xiàn)大鼠的神經(jīng)功能缺損評分明顯低于不給藥的大鼠，同時腦含水量下降，推斷紅景天苷對急性腦出血大鼠腦組織具有一定的保護作用。

髓過氧化物酶又稱過氧化物酶，是血紅素輔基的血紅素蛋白酶，具有還原過氧化氫的作用，在成熟的粒細胞中，約占總蛋白質(zhì)含量的5%，因此MPO活性可以用來測定中性粒細胞的數(shù)目。急性腦出血的早期會出現(xiàn)白細胞與中性粒細胞含量的升高，而研究表明白細胞與中性粒細胞計數(shù)的增高提示病情嚴重，預(yù)后差[5]。本研究結(jié)果顯示，急性腦出血大鼠腦組織中MPO的活性顯著上升，并隨時間延長而略有下降，經(jīng)過紅景天苷處理后，大鼠腦組織中MPO明顯低于腦出血大鼠，提示紅景天苷可能對于腦出血炎癥具有一定程度的抑制作用。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α是受乏氧調(diào)節(jié)的亞基，對缺氧和常氧產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)，在正常狀態(tài)下組織幾乎不表達，但在低氧狀態(tài)下，HIF-1α的表達增高，并與缺氧程度與缺氧時間相關(guān)[6]。HIF-1α的陽性表達率隨腦出血時間延長而增加[7]，另外有調(diào)查指出缺氧誘導(dǎo)生成的HIF-1α具有保護腦組織損害的作用[8]。本實驗結(jié)果顯示，腦出血大鼠腦組織中HIF-1α的表達明顯增加，而采用紅景天苷處理后，血腫周圍腦組織中HIF-1α的表達顯著高于腦出血組，推測出現(xiàn)腦出血后機體中的HIF-1α?xí)险{(diào)，HIF-1α具有保護腦組織免受損害的作用，提示紅景天苷對腦出血后腦組織的損傷具有保護作用。

血管內(nèi)皮生長因子是HIF-1α的目的基因，能增加微血管與小靜脈血管的通透性。在血管形成之前，VEGF對神經(jīng)系統(tǒng)具有直接的保護作用，研究表明具有一定的促神經(jīng)再生作用，在腦缺血灶周腦組織中VEGF的表達顯著上升，微血管密度顯著增加，有效改善缺血半暗帶的血塊[9]。本實驗結(jié)果顯示，采用紅景天苷處理后，腦出血大鼠血腫周圍腦組織的VEGF表達明顯高于未處理大鼠，推測紅景天苷通過上調(diào)VEGF的表達，改善微血管與小靜脈血管的通透性，促進微血管新生，從而保護腦出血損傷的腦組織。