大葉胡枝子根皮提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用研究

鐘衛(wèi)華，梁生林

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大葉胡枝子根皮提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用研究

鐘衛(wèi)華1，*梁生林2

（1．井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西，吉安 343000；2．井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江西，吉安 343009）

探討大葉胡枝子根皮提取物灌胃給藥的抗炎鎮(zhèn)痛作用。采用二甲苯致小鼠耳腫脹、蛋清致大鼠足跖腫脹2種急性炎癥模型以及大鼠棉球肉芽腫慢性炎癥模型，研究大葉胡枝子根皮提取物灌胃給藥對(duì)急慢性炎癥的作用。采用熱板法和醋酸扭體法致痛，研究大葉胡枝子根皮提取物灌胃給藥的鎮(zhèn)痛作用。與模型組相比，大葉胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低劑量組顯著抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹（< 0.01），明顯抑制蛋清所致大鼠足跖腫脹（< 0.01），明顯抑制大鼠棉球肉芽腫（< 0.01）。大葉胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低劑量組給藥后明顯提高熱板所致小鼠的痛閾值，與模型組和自身給藥前比較差異顯著（< 0.05、0.01）；大葉胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低劑量組明顯減少醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，與模型組比較差異顯著（< 0.05、0.01）。大葉胡枝子根皮水提物的抗炎鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于醇提物（< 0.05、0.01）。大葉胡枝子根皮提取物灌胃給藥具有一定抗炎、鎮(zhèn)痛作用，且其水提物強(qiáng)于醇提物。

大葉胡枝子根皮；提取物；抗炎；鎮(zhèn)痛

大葉胡枝子（Franch.）為豆科（Leguminosae）胡枝子屬（Lespedeza Michx.）植物，別名大葉烏梢、大葉馬料梢、活血丹。其廣泛分布于江西、浙江、湖南、廣東、廣西、貴州等地。以根、葉<入藥，性平、味甘，具宣開毛竅、通經(jīng)活絡(luò)等功效，可用于疹痧不透、頭暈眼花、汗不出、手臂酸麻等的治療>[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，大葉胡枝子莖皮、根皮主要含黃酮類[3-5]，具有抗早孕[6]等作用。但有關(guān)大葉胡枝子根皮的抗炎鎮(zhèn)痛作用未見報(bào)道。本研究采用小鼠耳腫法、大鼠足腫法及棉球法的炎癥模型和小鼠熱板法、醋酸扭體法疼痛模型來(lái)探討大葉胡枝子根皮提取物灌胃給藥是否有抗炎鎮(zhèn)痛作用，水提物和醇提物抗炎鎮(zhèn)痛作用是否有差異，旨在為大葉胡枝子進(jìn)一步開發(fā)利用和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。入藥，性平、味甘，具宣開毛竅、通經(jīng)活絡(luò)等功效，可用于疹痧不透、頭暈眼花、汗不出、手臂酸麻等的治療

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量18~24 g，雌雄兼?zhèn)洌?SD大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量180~250 g，雌雄各半，均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0003。

1.2 藥物與試劑

大葉胡枝子根皮采于江西吉安，經(jīng)井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)系周秋貴副教授鑒定為豆科胡枝子屬植物大葉胡枝子（Franch.）；阿司匹林片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司（進(jìn)口分裝），規(guī)格0.1 g/片，批號(hào)BJ04931），鹽酸嗎啡注射液（東北制藥集團(tuán)公司沈陽(yáng)第一制藥廠，規(guī)格10 mg/mL ，批號(hào)160701-2），戊巴比妥鈉（上海西唐生物科技有限公司，批號(hào)WS20160112），二甲苯（中國(guó)上海試劑一廠，批號(hào)20160201），36%醋酸（上海松江佘山化工廠）。

1.3 儀器

YLS-25A 電動(dòng)耳腫打耳器（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；PV-200足腫容量測(cè)量?jī)x（成都泰盟軟件有限公司）；RB-200智能熱板儀（成都泰盟軟件有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱（上海新苗醫(yī)療器材制造有限公司）。

2 方法

2.1 大葉胡枝子根皮提取物的制備

2.1.1 水提物的制備

取切成小段的干燥大葉胡枝子根皮300 g，用純化水浸泡0.5 h，加10倍量純化水（第一次多加2倍量）用文火煎煮3次，第1次1 h，后2次各0.5 h，合并3次煎出液，靜置去渣，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮為浸膏狀，貯存于4℃下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 醇提物的制備

用回流提取法，將300 g干燥大葉胡枝子根皮適度粉碎，用80%乙醇浸泡24 h，水浴中加熱回流提取3次，第1次回流1 h，第2及第3次各0.5 h，合并3次提取液，回收乙醇，減壓蒸干，貯存于4℃下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 大葉胡枝子根皮提取物的抗炎實(shí)驗(yàn)

2.2.1 小鼠耳腫法[7-8]

將96只昆明種小鼠，按體質(zhì)量和性別隨機(jī)均分為8組：模型組（純化水，10 mL/kg），阿司匹林（0.5 g/kg）陽(yáng)性對(duì)照組，大葉胡枝子根皮水提物和醇提物（生藥10.0、5.0、2.5 g/kg）組。大葉胡枝子的給藥劑量參考全國(guó)中草藥匯編成人每日用量25~50 g，換算成小鼠的劑量為5.0~10.0 g/kg。小鼠均灌胃給藥，給藥容量均為10 mL/kg，1次/d，連續(xù)給藥5 d。末次給藥1 h后每只小鼠左耳廓兩面均勻涂抹100%二甲苯0.05 mL致炎，右耳作對(duì)照。1 h后脫頸椎處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑8 mm電動(dòng)耳腫打耳器分別在左右耳同一部位沖下圓形耳片，電子天平稱質(zhì)量，以兩耳片的質(zhì)量差作為耳腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率。

耳腫脹度＝左耳片質(zhì)量－右耳片質(zhì)量。

耳腫脹抑制率（%）＝（模型組耳腫脹度－給藥組耳腫脹度）/ 模型組耳腫脹度×100%。

2.2.2 大鼠足腫法[7]

80只SD大鼠，雌雄各半，按體質(zhì)量和性別隨機(jī)均分為8組，具體分組方法及給藥方法同“2. 2. 1”項(xiàng)。末次給藥后1 h，每只大鼠左后足跖皮下注射10%蛋清生理鹽水溶液（臨用時(shí)新鮮配制）0.1 mL致炎，用容積法分別測(cè)定各鼠致炎前及致炎后1、2、4、6 h的足跖容積，記錄結(jié)果，并計(jì)算腫脹率。

足腫脹率（%）＝（致炎后足跖容積－致炎前足跖容積）/ 致炎前足跖容積×100%。

2.2.3 大鼠棉球法[7]

大鼠分組同“2. 2. 2”項(xiàng)。大鼠用1%戊巴比妥鈉5 mL/kg腹腔注射麻醉后，在每只鼠兩側(cè)腹股溝用碘伏消毒，75%酒精棉球脫碘后，各切1 cm長(zhǎng)小口，用眼科鑷將20 mg的滅菌棉球（10 g/L氨芐西林液浸泡，烘干）從切口處植入皮下，隨即縫合皮膚。次日開始給藥，給藥途徑及量同“2. 2. 2”項(xiàng)，連續(xù)給藥7 d。第8天將大鼠脫頸椎處死，打開原切口，將棉球連同周圍結(jié)締組織一起取出，剔除脂肪組織，放電熱恒溫干燥箱60 ℃干燥24 h烘干，稱質(zhì)量。將稱得的質(zhì)量減去棉球原質(zhì)量即得肉芽腫質(zhì)量，計(jì)算肉芽腫抑制率。

肉芽腫抑制率（%）＝（模型組肉芽腫質(zhì)量－給藥組肉芽腫質(zhì)量）/ 模型組肉芽腫質(zhì)量×100%。

2.3 大葉胡枝子根皮提取物的鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

2.3.1 熱板法[7-8]

熱板加熱至（55 ± 0.1）℃并恒定，把小鼠放置熱板上，記錄小鼠從放置熱板至出現(xiàn)舔后足反應(yīng)所需時(shí)間（s），小于5 s或大于30 s或跳躍的都棄之不用。取篩選合格的雌性小鼠96只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為8組，每組12只，除陽(yáng)性對(duì)照組為鹽酸嗎啡（0.02 g/kg）外，其余各組同“2. 2. 1”項(xiàng)。將每只小鼠正常痛閾值各測(cè)2次，每次間隔10 min，取其平均值為給藥前正常痛閾值。給藥除陽(yáng)性對(duì)照組皮下注射鹽酸嗎啡溶液2 d外，其余各組同“2. 2. 1”項(xiàng)。末次給藥后30、60、90、120 min各測(cè)小鼠痛閾值，如果用藥后放入熱板60 s仍無(wú)反應(yīng)，即將小鼠取出，以免時(shí)間太長(zhǎng)把腳燙傷，其痛閾值按60 s計(jì)算。

2.3.2 醋酸扭體法[7-8]

小鼠96只，雌雄各半，按體質(zhì)量和性別隨機(jī)分為8組，每組12只，組別及給藥同“2. 2. 1”項(xiàng)。末次給藥后1 h，各鼠均腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL/只（醋酸溶液臨用前配制）。記錄各組小鼠腹腔注射醋酸后15 min內(nèi)扭體反應(yīng)（腹部收縮內(nèi)凹、伸展后肢）次數(shù)，并計(jì)算抑制率。

抑制率（%）=（模型組扭體反應(yīng)次數(shù)－給藥組扭體反應(yīng)次數(shù)）/模型組扭體反應(yīng)次數(shù)×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

與模型組相比，大葉胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低劑量（生藥10.0、5.0、2.5 g/kg）組對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹均有明顯抑制作用（< 0.01），且耳腫脹抑制率與劑量呈正相關(guān)；阿司匹林0.5 g/kg對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹也具有顯著抑制作用（< 0.01）。大葉胡枝子根皮水提物高、中、低劑量作用強(qiáng)度與阿司匹林比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）。大葉胡枝子根皮水提物與相同劑量醇提物組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.01），顯示水提物作用強(qiáng)于醇提物。結(jié)果見表1。

表1 大葉胡枝子根皮提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（, n = 12）

注：與模型組比較，**< 0.01；與阿司匹林組比較，#> 0.05；與相同劑量醇提物組比較，&&< 0.01

3.2 對(duì)蛋清致大鼠足跖腫脹的影響

與模型組相比，大葉胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低劑量（生藥10.0、5.0、2.5 g/kg）組和阿司匹林0.5 g/kg對(duì)蛋清所致大鼠足跖腫脹有明顯抑制作用（< 0.01）。大葉胡枝子根皮水提物高劑量組給藥后1、4、6 h作用強(qiáng)度與阿司匹林比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）。大葉胡枝子根皮水提物高、中、低劑量組給藥后與相同劑量的醇提物組比較，抑制大鼠足跖腫脹更明顯（< 0.05、0.01），顯示水提物作用強(qiáng)于醇提物。結(jié)果見表2。

表2 大葉胡枝子根皮提取物對(duì)蛋清致大鼠足跖腫脹的影響（, n = 10）

注：與模型組比較，**< 0.01；與阿司匹林組比較，#> 0.05；與相同劑量醇提物組比較，&< 0.05&&< 0.01

3.3 對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響

與模型組相比，大葉胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低劑量（生藥10.0、5.0、2.5 g/kg）組和阿司匹林0.5 g/kg對(duì)大鼠棉球肉芽腫慢性炎癥均有顯著抑制作用（< 0.01）。大葉胡枝子根皮水提物高、中、低劑量與醇提物高劑量作用強(qiáng)度與阿司匹林比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）。大葉胡枝子根皮水提物與相同劑量醇提物組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05、0.01），顯示水提物作用強(qiáng)于醇提物。結(jié)果見表3。

表3 大葉胡枝子根皮提取物對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響（, n =10）

注：與模型組比較，**< 0.01；與阿司匹林組比較，#> 0.05；與相同劑量醇提物組比較，&< 0.05&&< 0.01

3.4 對(duì)熱板法致小鼠疼痛的影響

與模型組相比，給藥前各組痛閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）；大葉胡枝子根皮水提物高、中、低劑量（生藥10.0、5.0、2.5 g/kg）組和醇提物高、中劑量（生藥10.0、5.0 g/kg）組給藥后60、90、120 min明顯提高熱板所致小鼠的痛閾值（< 0.05、0.01），醇提物低劑量（生藥2.5 g/kg）組給藥后90、120 min明顯提高熱板所致小鼠的痛閾值（< 0.05），且具劑量依賴性；嗎啡溶液（0.02 g/kg）組給藥后30、60、90、120 min顯著提高熱板所致小鼠的痛閾值（< 0.01）。

與自身給藥前相比，模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）；大葉胡枝子根皮水提物高、中、低劑量（生藥10.0、5.0、2.5 g/kg）組和醇提物高、中劑量（生藥10.0、5.0 g/kg）組給藥后60、90、120 min明顯提高熱板所致小鼠的痛閾值（< 0.05、0.01），醇提物低劑量（生藥2.5 g/kg）組給藥后90、120 min明顯提高熱板所致小鼠的痛閾值（< 0.01）。結(jié)果見表4。

表4 大葉胡枝子根皮提取物對(duì)小鼠熱板法痛閾值的影響（, n =12）

注：與模型組比較，*< 0.05**< 0.01；與自身藥前痛閾比較，#< 0.05##< 0.01；

3.5 對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

與模型組相比，大葉胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低劑量（生藥10.0、5.0、2.5 g/kg）組和阿司匹林0.5 g/kg均能明顯減少醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)（< 0.05、0.01）。大葉胡枝子根皮水提物高、中、低劑量組給藥后與相同劑量的醇提物組相比，扭體反應(yīng)次數(shù)明顯減少（< 0.01），顯示大葉胡枝子根皮水提物作用強(qiáng)于醇提物。結(jié)果見表5。

表5 大葉胡枝子根皮提取物對(duì)小鼠扭體次數(shù)的抑制作用（, n =12）

注：與模型組比較，*< 0.05**< 0.01；與相同劑量醇提物組比較，&&< 0.01

4 討論

二甲苯所致小鼠耳廓腫脹及蛋清所致大鼠足跖腫脹是以水腫和滲出為主的急性炎癥反應(yīng)[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大葉胡枝子根皮提取物灌胃給藥明顯減輕二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，可明顯抑制蛋清所致大鼠足跖腫脹，表明大葉胡枝子根皮提取物灌胃給藥對(duì)急性炎癥具有顯著抑制作用。另外，本實(shí)驗(yàn)也采用大鼠棉球肉芽腫模型來(lái)探討大葉胡枝子根皮對(duì)慢性炎癥反應(yīng)的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大葉胡枝子根皮提取物灌胃給藥可顯著抑制大鼠肉芽腫增生，表明大葉胡枝子根皮提取物灌胃給藥對(duì)慢性炎癥也具有顯著抑制作用。

在鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中，我們采用了熱板法和扭體法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠熱板實(shí)驗(yàn)是通過(guò)一定溫度（55 ℃）刺激小鼠足部以產(chǎn)生疼痛反應(yīng)，可表現(xiàn)為跳躍、縮足或舔足反應(yīng)。常以熱刺激開始至出現(xiàn)舔后足反應(yīng)的時(shí)間（即潛伏期）為測(cè)痛指標(biāo)[10]，并以此作為評(píng)價(jià)藥物的鎮(zhèn)痛作用。本實(shí)驗(yàn)顯示大葉胡枝子根皮提取物能明顯提高熱板法所致小鼠的痛閾值，這表明大葉胡枝子根皮對(duì)溫度等物理因素導(dǎo)致的疼痛有鎮(zhèn)痛作用。熱板反應(yīng)有高位中樞參與[11]，這也說(shuō)明大葉胡枝子根皮有一定中樞性鎮(zhèn)痛作用。

醋酸是一種刺激性化學(xué)物質(zhì)，小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)是通過(guò)醋酸刺激臟層和壁層腹膜引起深部較大面積、較長(zhǎng)時(shí)間的炎性疼痛，表現(xiàn)為扭體反應(yīng)，這是篩選弱鎮(zhèn)痛藥的一種簡(jiǎn)便、敏感、重復(fù)性好的方法[11]。醋酸介導(dǎo)的傷害性反應(yīng)可能由于腹腔pH值降低而直接刺激傳入神經(jīng)纖維和炎癥介質(zhì)合成共同作用導(dǎo)致[12]。本實(shí)驗(yàn)中，大葉胡枝子根皮提取物能明顯減少醋酸誘發(fā)的小鼠扭體反應(yīng)，提示大葉胡枝子根皮提取物對(duì)于炎癥性疼痛有一定的鎮(zhèn)痛作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，大葉胡枝子根皮提取物在抗炎、鎮(zhèn)痛作用方面，作用其強(qiáng)度與劑量呈正相關(guān)，而其水提物作用強(qiáng)于醇提物。

綜上所述，本研究采用了3種炎癥動(dòng)物模型和2種疼痛動(dòng)物模型來(lái)研究大葉胡枝子根皮提取物的抗炎鎮(zhèn)痛作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大葉胡枝子根皮提取物灌胃給藥對(duì)急、慢性炎癥均具有良好的抑制作用；在鎮(zhèn)痛方面，無(wú)論是物理性疼痛，還是炎癥性疼痛都具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，而且兼有良好的中樞和外周鎮(zhèn)痛活性；在抗炎鎮(zhèn)痛方面水提物作用強(qiáng)于醇提物，這和人們平時(shí)用水煎藥的習(xí)慣一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為其綜合開發(fā)利用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。其抗炎鎮(zhèn)痛有效部位、活性成份及作用機(jī)制等有待于進(jìn)一步研究。

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ANTI-INFLAMMATORY AND ANALGESIC EFFECTS OF THE ROOT BARK EXTRACT OF

ZHONG Wei-hua1,*LIANG Sheng-lin2

(1. Affiliated Hospital of Jinggangshan University, Jiangxi, Ji′an 343000, China; 2. Faculty of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

To investigate the anti-inflammatory andanalgesic effects of the root bark extract ofby intragastric administration.The anti-inflammatory animal models were used in researching the effects oftheextract on acute and chronic inflammation. The acute models were xylene-induced ear edema and egg white-induced pawedema, while the chronic one was granuloma induced bycotton pellet implantation. Meanwhile, the analgesic effects of that extract were observed by hot plate and acetic acid writhing test.Compared with the model group, high, middle and low doses of the root bark water extract and alcohol extract ofcould significantly inhibit ear edema in mice (< 0.01) and the paw edema in rat (< 0.01). Also, the water and alcohol extract decreased the granuloma of rats (< 0.01). Moreover, the pain thresholdwith hot plate method was significantly increased (< 0.05, 0.01) compared with the modelgroup and the data before the drugs administration of high, middle and low doses of the water extract and alcohol extract. And contrasted to the model group after extract administration, the writhing number was reduced (< 0.05, 0.01). However, there were substantial variations in the water extract groups and the same dose of alcohol extract in high, middle and low concentrations (< 0.05, 0.01).The root bark extract ofpossesses the anti-inflammatory andanalgesic effects, and water extract were better than alcohol extracts.

the root bark of; extract; intragastric administration; anti-inflammatory;analgesic

1674-8085(2019)01-0082-06

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2019.01.017

2018-09-29；

2018-10-19

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目子課題項(xiàng)目(2012BAC11B02)

鐘衛(wèi)華(1976-)，女，江西吉安人，副主任醫(yī)師，主要從事B超臨床及中草藥研究(E-mail: 269568714@qq.com);

*梁生林(1962-)，男，江西吉安縣人，教授，主要從事中草藥藥理及毒理研究(E-mail: slliang1962@163.com).