31例多發(fā)性硬化患者T淋巴細胞亞群及相關(guān)細胞因子的檢測

李丹

（威海市立醫(yī)院南院區(qū)檢驗科，威海264200）

多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊?，常見于歐美國家，中國發(fā)病率較低，為1/10萬~2/10萬[1]。MS確切的病因及發(fā)病機制尚未清楚。通常認為，MS的發(fā)生與遺傳因素、自身免疫反應(yīng)及環(huán)境因素關(guān)系密切。主要病理改變是免疫活性細胞浸潤、軸索損傷及髓鞘脫失，主要的臨床表現(xiàn)為進行性神經(jīng)功能障礙，隨著病程的進展，雙下肢癱瘓為絕大多數(shù)患者最終的結(jié)果。目前為止尚無根治MS的方法，常用的是激素治療和免疫抑制，可明顯緩解急性期和復(fù)發(fā)期的病程，但病損程度卻不能減輕，長期療效也不肯定，且毒副作用很大。本文通過對31例MS患者靜脈血T淋巴細胞亞群及相關(guān)細胞因子含量的檢測，探討Th17細胞、Treg細胞在多發(fā)性硬化發(fā)病中的作用，為今后臨床治療多發(fā)性硬化提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月-2017年8月威海市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及住院MS患者31例，男13例，女18例；平均年齡（37±11）歲，均符合 2005年修訂的Mcdonald診斷標準；正常對照組選自同期該院健康體檢者20例，平均年齡（38±12）歲。排除標準：（1）并發(fā)嚴重心、腦血管疾病，肝、腎功能不全；（2）急、慢性感染；（3）合并其他自身免疫性疾?。唬?）應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑、非甾體類抗炎藥物者；（5）腫瘤；（6）合并妊娠。

1.2 儀器與試劑 儀器采用美國BD FACSCalibur流式細胞儀，小鼠抗人熒光標記的抗體、同型對照抗體小鼠IgG，流式微球芯片捕獲技術(shù)細胞因子試劑盒均購自美國BD公司；小鼠抗人IL-17-FITC購自eBiocience公司；淋巴細胞分離液、佛波酯乙醇、離子霉素、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑莫能霉素購自Sigma公司。

1.3 標本采集 31例門診及住院MS患者初診和潑尼松治療4周后均清晨空腹采集肘靜脈血標本5 mL于肝素鈉抗凝管中，3 mL血標本用于分離外周血單個核細胞進行流式細胞學(xué)檢測，2 mL血標本離心后留取血漿于EP管中保存在-80°C低溫冰箱中用于檢測細胞因子，隨機抽取20名同期健康體檢人員采集相應(yīng)血液標本作為對照檢查。

1.4 流式細胞儀檢測 T淋巴細胞亞群加入等體積PBS稀釋靜脈血，采用淋巴細胞分離液分離單個核細胞。加入10 mg/L的布雷菲德菌素A、1 mg/L的離子霉素和0.02 mg/L的佛波酯，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h。3 000 r/min離心5 min，棄去上清液收集細胞，調(diào)整細胞濃度至1×106/mL，取細胞懸液300 μL，按淋巴細胞亞群配對方案分別加入10 μL熒光標記mAbCD4-APC、CD8-PercP，室溫避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定20 min，加破膜緩沖液作用10 min。按組合方案加入相應(yīng)的小鼠抗人mAbIFN-γ-FITC、IL-4-PE、IL-17-FITC、FOXP3-PE，室溫避光孵育30 min，PBS充分洗滌，1%多聚甲醛固定，上機檢測，每份標本采集的細胞數(shù)≥20 000個，采用Cell Quest分析。

1.5 流式微球芯片捕獲技術(shù)（CBA）檢測血漿細胞因子 通過BD FACSComp軟件設(shè)置FCM的基本參數(shù)，按照試劑盒中細胞因子標準品梯度法依次稀釋成以下 8 個濃度：1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128和1∶256，加上陰性對照和最高濃度繪制各細胞因子標準曲線。待測血漿1 500 r/min離心5 min，吸取50μL上清液于待測管中，加入5種捕獲微球混合物 50 μL，孵育 1 h，再加入 50 μL PE 檢測試劑，室溫避光孵育2 h。加入1 mL洗液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入300μL洗液上機，使用CellQuest檢測。將標準品和待測樣品捕獲數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)入BD FCAP Array軟件，繪出標準曲線，分析待測樣品的細胞因子 IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4、IL-10 含量。

2 結(jié)果

2.1 3組外周血T淋巴細胞亞群與正常組比較 MS組Th1細胞和Th17細胞均明顯升高（P＜0.05）；Treg細胞和TC1細胞顯著下降（P＜0.01），Th17/Treg比例明顯升高（P＜0.01）；與 MS 組比較，潑尼松組 Tc1、Tc2和Treg細胞百分率均明顯升高（P＜0.01），而Th1和 Th17細胞顯著下降（P＜0.05)，Th17/Treg比值降低（P＜0.01）（表 1，圖 1）。

2.2 血漿細胞因子的變化與正常組比較 MS組IFN-γ 和 IL-17A 含量升高（P＜0.05；P＜0.01），IL-4 和IL-10含量明顯降低（P＜0.01）；與 MS組比較，潑尼松組IL-17A含量明顯降低（P＜0.01），IL-4和IL-10均顯著升高（P＜0.01）（表 2）。

表1 3組外周血T淋巴細胞亞群的變化（±s）Tab 1 Changes of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in three groups（±s）

表1 3組外周血T淋巴細胞亞群的變化（±s）Tab 1 Changes of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in three groups（±s）

▲：P＜0.01,vs正常組；#：P＜0.05，*：P＜0.01，vsMS 組

組別T淋巴細胞亞群/% Th1/Th2 Th17/Treg Th1 Th2 Th17 Treg TC1 TC2正常組 0.54±0.27 1.96±0.44 3.12±1.67 35.04±4.21 3.39±1.42 4.57±1.87 0.36±0.12 0.10±0.02 MS 組 1.57±0.20▲ 1.84±0.36 15.24±2.54▲ 10.12±4.13▲ 0.62±0.18▲ 3.35±1.31 0.91±0.33 1.51±0.62▲潑尼松組 0.70±0.30# 1.13±0.39 6.12±2.04# 29.52±12.01* 2.97±0.69* 13.70±7.22* 0.61±0.97 0.19±0.07*

圖1 3組外周血淋巴細胞亞群FCM圖Fig 1 Phenotype of lymphocyte subsets analyzed by FCM in three groups

表 2 3 組血漿細胞因子的含量（±s，pg/mL）Tab 2 Concentrations of plasma cytokines in three groups（±s，pg/mL）

表 2 3 組血漿細胞因子的含量（±s，pg/mL）Tab 2 Concentrations of plasma cytokines in three groups（±s，pg/mL）

▲：P＜0.05，&：P＜0.01，vs正常組；*：P＜0.01，vsMS 組

組別 Th1型細胞因子 Th2型細胞因子 Th17型細胞因子IFN-γ TNF-α IL-10 IL-4 IL-17A正常組 8.53±1.42 378.21±283.72 36.65±15.41 13.07±7.24 22.53±2.26 MS 組 17.54±4.20▲ 241.03±132.40 12.10±10.21& 3.83±1.10& 269.97±75.93&潑尼松組 12.40±1.30 211.04±110.45 66.45±14.31* 9.20±1.93* 50.63±8.62*

3 討論

過去普遍認為，Th1細胞活性異常升高是MS的重要免疫發(fā)病機制，MS是由Th1細胞介導(dǎo)的。近年來，Th17細胞成為免疫學(xué)研究的熱點，研究發(fā)現(xiàn)其在自身免疫性疾病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。Th17細胞是一類獨立的CD4+T細胞，因活化后可以產(chǎn)生IL-17而得名，IL-17是早期產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的炎性細胞因子，Th17細胞同時也分泌IL-21、IL-22、IL-26、IL-29和 TNF-α 等，這些細胞因子可以誘導(dǎo)促炎性細胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，引起組織細胞炎性浸潤和組織破壞[3]，進而引起自身免疫性疾病的發(fā)生。已有研究證明在MS患者病灶中IL-17轉(zhuǎn)錄上調(diào)，且腦脊液中IL-17表達明顯高于正常對照組[4]。國內(nèi)研究已證明在多發(fā)性硬化動物模型 EAE（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE） 大鼠外周血中CD4+IL-17+（Th17）細胞亞群百分率明顯升高，且在EAE模型組腦和脊髓組織呈現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，有血管套形成[5-6]。

本研究中MS患者靜脈血中Th1和Th17細胞亞群百分率明顯升高，而Treg細胞百分比顯著降低，且Th17/Treg比例也明顯升高。有研究報道，F(xiàn)oxP3+Treg可以調(diào)節(jié)機體對外源性抗原免疫反應(yīng)的程度，其功能失調(diào)與多種疾病密切相關(guān)如自身免疫性疾病、過敏性疾病、感染性疾病等[7-8]。正常情況下，Th17和FoxP3+Treg細胞之間相互拮抗、制約，維持兩者的生理平衡是機體抗感染免疫和自身免疫耐受的重要機制。通過本實驗推測，MS的發(fā)生與Th17/Treg比例失衡關(guān)系密切。因此探討靶向抑制Th17細胞和調(diào)節(jié)FoxP3+Treg細胞是目前自身免疫性疾病重要的免疫治療方向。目前，臨床上治療多發(fā)性硬化大多應(yīng)用激素和非特異性的免疫抑制劑，本實驗中潑尼松治療組Tc1、Tc2和Treg細胞百分率均明顯升高，而Th1和Th17細胞顯著下降，Th17/Treg比值降低；IL-17A含量明顯降低，IL-4和IL-10均顯著升高，在一定程度上可以緩解MS的癥狀，但是毒副作用較大,不適合長期使用，因此，尋找靶向免疫調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡可能是今后臨床治療MS的新希望。已有研究報道，干細胞不僅具有自我復(fù)制及定向分化的功能，更能發(fā)揮巨大的免疫調(diào)節(jié)功能，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE） 模型具有明顯的效果，主要是MSCs抑制T淋巴細胞增殖，下調(diào)Th1和Th17，上調(diào)Th2和Treg細胞，糾正Th1/Th2、Th17/Treg失衡，機制可能主要與其抑制炎性細胞因子及促進抗炎細胞因子分泌密切相關(guān)[9-13]。國內(nèi)也已有研究證實人羊膜間充質(zhì)干細胞、人羊膜上皮細胞，可以下調(diào)Th17細胞的表達，上調(diào)FoxP3+Treg細胞的表達，糾正Th17/Treg失衡[5-6]。

在免疫系統(tǒng)中，各類細胞因子相互協(xié)同或制約發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，本文通過檢測Th1和Th2型細胞因子發(fā)現(xiàn)，MS組Th1型細胞因子IFN-γ含量均明顯高于正常組，Th2型細胞因子IL-10和IL-4則明顯降低，推測通過調(diào)節(jié)Th1/Th2型細胞因子的平衡也是減輕MS免疫損傷的重要機制之一。本實驗采用CBA方法檢測血漿細胞因子含量，與傳統(tǒng)的ELISA和Western blot技術(shù)相比，該種方法不僅標本用量少，檢測速度更快，結(jié)果更精準，靈敏度更高，值得臨床研究及實驗室廣泛應(yīng)用。同時，本研究由于樣本量較少也存在一定的局限性，今后的研究中要增加臨床樣本量，降低結(jié)果的誤差。本實驗推測，MS的發(fā)生與Th17/Treg比例失衡和Th1/Th2型細胞因子的失衡關(guān)系密切，但在MS的發(fā)生發(fā)展過程中具體通過什么途徑促使Th17表達上調(diào)，Treg表達下調(diào)，還不完全清楚，是今后研究的重點內(nèi)容，此外TC1和TC2淋巴細胞亞群在MS中意義尚不清楚，值得進一步探討。