冠心病患者外周血中l(wèi)ncRNA-ANRIL的表達(dá)水平及其臨床意義

王 娜 ，張學(xué)軍

（1.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系,天津300070；2.天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院檢驗(yàn)科,天津300100）

冠心病引起的心肌梗死等卒中性疾病目前依然是全球人口死亡和殘疾的主要原因[1-2]。盡管目前心血管介入治療技術(shù)發(fā)展迅速，但仍有相當(dāng)大比例的冠心病患者在早期未能準(zhǔn)確診斷，并且在心梗發(fā)作時(shí)不能得到有效的救治，急性冠脈綜合征等冠心病嚴(yán)重階段將會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死、凋亡、肥大或纖維化。目前研究發(fā)現(xiàn)冠心病所致心肌損傷的一部分機(jī)制是通過(guò)基因表達(dá)的下調(diào)而誘導(dǎo)的，非編碼RNAs被任意分為短非編碼RNAs(microRNA，20~22個(gè)核苷酸長(zhǎng))和長(zhǎng)非編碼 RNAs(lncRNAs，200 個(gè)核苷酸)。miRNAs主要通過(guò)調(diào)節(jié)靶信使RNA的功能來(lái)下調(diào)基因表達(dá)[3]，但lncRNAs對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控更為復(fù)雜，包括激活或抑制基因表達(dá)、調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等[4]。目前多項(xiàng)研究報(bào)道lncRNA已經(jīng)成為腫瘤學(xué)領(lǐng)域中進(jìn)行診斷的新的生物標(biāo)志物以及腫瘤治療的新靶點(diǎn)[4-5]，然而，筆者對(duì)lncRNAs在心血管疾病中的作用認(rèn)識(shí)還處于初步階段，本研究主要探索了lncRNA-ANRIL于冠心病病人外周血清中的表達(dá)及其診斷意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年2月-2018年2月來(lái)自天津市大港醫(yī)院行冠狀動(dòng)脈CT造影或冠脈CT的患者231例，定義為冠心病組，男性189例，女性42例，平均年齡（63.42±10.75）歲；同時(shí)選取健康志愿者447例，定義為對(duì)照組，男性359例，女性88例，平均年齡（61.17±9.84）歲。冠心病組納入標(biāo)準(zhǔn)：冠脈CT造影檢查：右冠狀動(dòng)脈、左回旋支、左前降支、左主干的主要血管，根據(jù)Judkins標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)血管進(jìn)行至少3個(gè)多體位頭測(cè)定，結(jié)果示≥1支血管直徑出現(xiàn)超過(guò)50%的狹窄確診為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有嚴(yán)重肝腎功能不全、周?chē)苄约膊?、腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、急慢性感染性疾病、慢性阻塞性肺疾病、心律失常、瓣膜性心臟病等。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 Trizol試劑購(gòu)自invitrogen公司，根據(jù)圖1 9p21區(qū)域基因轉(zhuǎn)錄圖譜，選擇lnc RNA-ANRIL、CDKN2A、CDKN2B、GAPDH 基 因 作為引物合成對(duì)象，上下游引物由武漢金凱瑞公司合成。SYBR GREEN Master Mix與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自賽默飛世爾公司。

圖1 9p21區(qū)域基因轉(zhuǎn)錄圖譜Fig 1 9p21 regional gene transcription map

1.3 血液樣品采集 抽取兩組患者晨起空腹肘靜脈血7 mL于EDTA抗凝管中，控溫離心機(jī)4℃，3000 r/min離心血液樣本15min，取上層清液即血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)，受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.4 血清總RNA提取及cDNA第一鏈合成 取100 μL 血清，加入 900 μL Trizol，于室溫下充分混勻15 min，加入 200 μL 氯仿，劇烈震蕩 15 s，室溫下靜置后4℃，12 000 r/min離心15 min，取上層清液450 μL，加入 450 μL丙二醇，輕柔顛倒混勻后再次相同條件離心15 min，此時(shí)可見(jiàn)RNA白色沉淀，75%乙醇潤(rùn)洗兩次后DEPC水溶解，調(diào)節(jié)各樣品RNA濃度均在1 000 ng/μL之內(nèi)，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明：各樣品均取 1μgRNA，1μLoligo（dt）（5 μg/μL）,補(bǔ) DEPC水至12 μL，65℃反應(yīng)5 min后迅速至冰上，加入 5×buffer 4 μL，RNase 抑制劑（20 U/μL）1 μL，RT 1 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，42 ℃孵育1 h，70℃孵育5 min后冰上冷卻即完成逆轉(zhuǎn)錄。

1.5 RT-PCR法測(cè)定外周血中ANRIL等相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況 通過(guò)Genebank中的ANRIL、CDKN2A、CDKN2B、GAPDH的序列，使用primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，ANRIL外顯子 1-2上游引物序列為：GCGCTGCCGGAGCTG,下游引物：CAGCATGGACA CCAATATTCTCTC，MGB 探針：CCGGACTAGGACT ATT。外顯子17-18上游引物：GCAATTCCAGTGCA AGTATGGTC，下游引物：CCACAATGTTCAACTTGCTGT，MGB 探 針 ：TGATCCAGT AGTATCTTAC。 其 中CDKN2A基因第一外顯子引物為上游5′-ACC CTG TCC CTC AAA TCC TC-3′，下游 5′-TGG CTC CTC ATT CCT CTT CCT T-3′；第二外顯子引物為上游5′-CAT CTA TGC GGG CAT GGT TA-3′，下游 5′-TGC AGC ACC ACC AGC GTG TC-3′；內(nèi)對(duì)照 β-珠蛋白為上游 5′-CGG GAA ATC GTG CGGAC-3′，下游5′-TCG CTC CAA CCG ACT GCT-3′。CDKN2B 基因上游 5′-CTATGTTTGAATAATTCCAG-3′，下游基因5′-CGCGTCGCCGCGUUAAGAAC-3′。建立10μL反應(yīng)體系：2×SYBR GREEN Master Mix 5 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 1 μL。RTPCR 反應(yīng)設(shè)置為：95℃反應(yīng)30 s，35個(gè)循環(huán)設(shè)定：95℃ 10 s、60℃30 s。通過(guò)循環(huán)數(shù)2△△ct法計(jì)算血清中各指標(biāo)的表達(dá)情況。

1.6 SNP檢測(cè)9p21基因區(qū)域3種單核苷酸多態(tài)性 正常及對(duì)照病人的血液樣本，提取其基因組DNA，利用Illumina Gold-en Gate技術(shù)和Bead Studio軟件包進(jìn)行SNP分型，所有SNP基因型測(cè)序準(zhǔn)確率為98%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±s表示，兩兩比較采用組間t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lnc RNA-ANRIL表達(dá)與冠心病相關(guān)性比較分析 冠心病組 ANRIL（外顯子1-2）與 ANRIL（外顯子17-18）的相對(duì)表達(dá)量均明顯小于對(duì)照組（均P＜0.01），見(jiàn)表1。通過(guò)ROC曲線可知ANRIL（外顯子1-2）對(duì)于診斷冠心病具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），曲線下面積為 0.894（95%CI 0.835~0.953），最佳臨界值（cut off值）為：0.945 0，敏感性為：50.88%，特異度為98.25%。ANRIL（外顯子17-18）對(duì)于診斷冠心病也具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），曲線下面積為 0.793（95%CI 0.711~0.875）,最佳臨界值（cut off值）為1.10，敏感性為45.61%，特異度為94.74%，見(jiàn)圖2。

表1 兩組lnc-ANRIL相對(duì)表達(dá)量比較Tab 1 Comparison of relative expression of lnc-ANRIL between the two groups

圖2ANRIL診斷冠心病ROC曲線分析Fig 2 ROC curve analysis of the diagnosis of coronary heart disease by ANRIL

2.2 9p21區(qū)域單核苷酸多態(tài)性與冠心病相關(guān)性比較分析 對(duì)冠心病組及對(duì)照組測(cè)定了9p21基因區(qū)域 3 種單核苷酸：rs1333049、rs564398、rs2811712 的多態(tài)性分布情況。結(jié)果顯示：rs1333049等位基因頻率在兩組受試者中具有顯著差異（P＜0.05），其中冠心病組等位基因G顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而rs564398與rs2811712等位基因頻率在兩組間的比較并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 2，圖 3。

2.3 rs1333049等位基因頻率G與lnc-ANRIL表達(dá)的相關(guān)性分析 分別測(cè)定了冠心病組rs133049等位基因G的分布與ANRIL（外顯子1-2）、ANRIL（外顯子17-18）的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者均呈正相關(guān)（r=0.340 2/0.312 4，均 P＜0.05），見(jiàn)圖 4。

表2 兩組單核苷酸等位基因頻率比較Tab 2 Comparison of rs1333049 single nucleotide allele frequencies between the two groups

圖3 兩組rs1333049基因型人數(shù)頻率比較Fig 3 Frequency comparison of rs1333049 genotypes in the groups

圖4 rs1333049等位基因G與ANRIL相關(guān)性分析Fig 4 Correlation analysis of rs1333049 allele G and ANRIL

2.4 lnc RNA-ANRIL表達(dá)與 CDKN2A、CDKN2B表達(dá)的相關(guān)性分析 分別測(cè)定了冠心病組lnc-RNA表達(dá)與CDKN2A、CDKN2B表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果示：lnc RNA-ANRIL（外顯子1-2）與CDKN2A、CDKN2B表達(dá)均呈正相關(guān)（均 P＜0.05），lncRNAANRIL（外顯子17-18）與CDKN2A的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.0001），而與CDKN2B的表達(dá)無(wú)相關(guān)性（圖5）。

圖5 ANRIL與CDKN2A、CDKN2B表達(dá)的相關(guān)性分析Fig 5 The correlation analysis of the expressions of ANRIL,CDKN2A and CDKN2B

3 討論

本研究主要探索了lncRNA-ANRIL于冠心病病人中的表達(dá)及其臨床意義，lncRNA-ANRIL屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNA，既往研究將lncRNA-ANRIL鑒定為與多種疾病相關(guān)的遺傳易感性位點(diǎn)，這些疾病包括2型糖尿病、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤及多種癌癥[6]。lncRNA ANRIL基因位于染色體9p21區(qū)域，全長(zhǎng)3.8 kb，在人體內(nèi)多種正常組織中均有表達(dá)。ANRIL基因序列的最后一個(gè)外顯子與9p21心血管疾病相關(guān)基因位點(diǎn)相鄰，因此我們同時(shí)分析了9p21基因區(qū)域單核苷酸的表達(dá)與之相關(guān)性。本研究涉及的另外兩個(gè)指標(biāo)：CDKN2A和CDKN2B（編碼p15KIK4B，P16UK4A和p14ARF）為兩個(gè)細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶抑制劑，位于lnc-RNA ANRIL關(guān)聯(lián)點(diǎn)附近，該兩種激酶抑制劑均在細(xì)胞增殖中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，并且在該過(guò)程中可有效吸附其它激酶。在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，CDKN2A/B被多梳蛋白所抑制，于細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)激活[7]。

目前有證據(jù)表明ANRIL可通過(guò)組蛋白修飾調(diào)節(jié)CDKN2A/B基因表達(dá)的作用。ANRIL可通過(guò)調(diào)節(jié)CDKN2A從而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老的作用，并且表現(xiàn)出衰老依賴(lài)的增殖作用[8]。ANRIL轉(zhuǎn)錄后可與Chrimbox 7（CBX7亞基的多梳抑制復(fù)合物1）整合從而沉默p16INK4A(CDKN2A)，并且可吸附多克隆抑制復(fù)合物 2（PRC2）從而沉默 p15INKB（CDKN2B）的表達(dá)[9]。此外，ANRIL是CDKN2B基因的反義物，對(duì)于CDKN2B有義序列的表達(dá)具有抑制作用。因此，在基因敲除ANRIL的情況下，CDKN2B位點(diǎn)的抑制將被削弱，CDKN2B將出現(xiàn)上調(diào)[10]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)ANRIL的減少與增多與CDKN2A表達(dá)呈正相關(guān)，PR復(fù)合假說(shuō)并不能解釋該種機(jī)制，這種減少似乎是由另一種機(jī)制所引起的。盡管目前的研究報(bào)道了ANRIL可通過(guò)多梳蛋白抑制CDKN2A/B基因座中的作用，但是ANRIL的每個(gè)剪接變體的具體作用以及轉(zhuǎn)錄物的所有可能功能仍然缺乏相應(yīng)的研究。因此本實(shí)驗(yàn)分別探討了ANRIL（外顯子1-2）、ANRIL（外顯子17-18）對(duì)于CDKN2A/B表達(dá)的相關(guān)性。

染色體9p21區(qū)域中與疾病相關(guān)的單核苷酸表達(dá)極為豐富，與該位點(diǎn)相關(guān)的一些基因表型與動(dòng)脈粥樣硬化性疾病、心肌梗死、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤和2型糖尿病有關(guān)[11-14]。此外，與其它遠(yuǎn)緣病因的疾病，如黑素瘤、皮膚痣、白血病、牙周炎和阿爾茨海默病、子宮內(nèi)膜異位癥和青光眼均有關(guān)聯(lián)[15-19]。全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）目前也已經(jīng)確定了染色體9p21位點(diǎn)基因的遺傳變異與心血管疾病的發(fā)生具有關(guān)聯(lián)性[20]。因此本研究測(cè)定了冠心病組及對(duì)照組9p21基因 區(qū) 域 3 種 單 核 苷 酸 ：rs1333049、rs564398、rs2811712的表達(dá)情況，該3種SNPs均在其它疾病中具有差異性的表達(dá)，分析了其不同基因型在冠心病病人中的差異性表達(dá)。

通過(guò)本次研究筆者發(fā)現(xiàn)：SNP rs1333049不同基因型的表達(dá)在冠心病人群與健康人群中存在顯著差異，rs1333049單核苷酸等位基因G的下降可能與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)，進(jìn)一步研究等位基因G與ANRIL表達(dá)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，該兩者表達(dá)存在正相關(guān)，說(shuō)明染色體9p21區(qū)域單核苷酸rs1333049等位基因可能參與調(diào)控了ANRIL的表達(dá)；此外冠心病病人血清中ANRIL的表達(dá)均低于正常受試者，通過(guò)ROC 曲線可以發(fā)現(xiàn) ANRIL（外顯子 1-2）、ANRIL(外顯子17-18)在診斷冠心病方面均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ANRIL可以作為診斷冠心病發(fā)病的高特異性指標(biāo)；最后本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ANRIL（外顯子1-2）與CDKN2A、CDKN2B表達(dá)均呈正相關(guān)，ANRIL(外顯子17-18)與CDKN2A的表達(dá)呈正相關(guān)。

綜上所述，ANRIL可能通過(guò)調(diào)控CDKN2A/B的表達(dá)影響冠心病的發(fā)生發(fā)展，ANRIL的表達(dá)可能受染色體9p21區(qū)域單核苷酸rs1333049表達(dá)的影響，外周血ANRIL的表達(dá)可以作為早期診斷冠心病的特異性指標(biāo)。