短鏈脂肪酸對C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞AMPK的作用研究

呂曉婷，洪宇桁，牛文彥

（1.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，天津300203）

糖尿病是因胰島素絕對或相對不足以及靶組織細(xì)胞對胰島素敏感性降低引起的代謝綜合征，高血糖為其主要標(biāo)志[1]。骨骼肌是機(jī)體攝取餐后葡萄糖的主要器官，攝取80%餐后升高的血糖，對維持血糖穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。運(yùn)動時骨骼肌收縮，促進(jìn)葡萄糖攝取，增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，是預(yù)防和治療2型糖尿病的有效方式[2]。單磷酸腺苷激活蛋白激酶（Adenosine 5′-monophosphateactivated protein kinase，AMPK）是由一個催化亞基（α）和兩個調(diào)節(jié)亞基（β，γ）組成的異三聚體酶，是細(xì)胞能量感受器[3-5]。運(yùn)動時肌肉收縮消耗能量，激活骨骼肌AMPK，進(jìn)而調(diào)節(jié)能量代謝[4]。近年來，腸道菌群在肥胖、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等代謝疾病中的作用成為研究熱點(diǎn)，已證實(shí)腸道菌群可通過調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝影響2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展[6]。有報道產(chǎn)丁酸菌對胰島素抵抗具有改善作用，短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）是腸道產(chǎn)丁酸菌的代謝終產(chǎn)物，其中乙酸、丙酸和丁酸占95%，短鏈脂肪酸在維持腸道水電解質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)腸道的菌群平衡、改善腸道功能、抗腫瘤和調(diào)控基因等方面發(fā)揮重要作用[7]。生理情況下，短鏈脂肪酸經(jīng)乙狀結(jié)腸和直腸吸收，經(jīng)下腔靜脈到達(dá)全身循環(huán)，作用于外周組織。短鏈脂肪酸也有改善機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性的作用,有助于預(yù)防肥胖及相關(guān)代謝疾病的發(fā)生，但其對骨骼肌糖代謝的作用機(jī)制仍需探究[7]。已有文獻(xiàn)支持乙酸鈉（NaAce）、丙酸鈉（NaPro）和丁酸鈉（NaBut）作用于 C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞[8]，因此本研究分別應(yīng)用乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉孵育C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞，探討短鏈脂肪酸對C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞AMPK的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠骨骼肌細(xì)胞株C2C12（美國ATCC公司），DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO公司），MTS試劑盒（美國Promega公司），牛血清白蛋白（中國鼎國生物技術(shù)公司），抗磷酸化AMPK抗體（美國CST公司），抗β-actin抗體（中國Absin公司），偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體（美國JacksonImmuno Research公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) C2C12細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)基接種于板中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度到80%時，用10%FBS DMEM高糖培基分別配置1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L 的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉，孵育C2C12細(xì)胞24 h。

1.2.2MTS實(shí)驗(yàn) 分別用0mmol/L，1mmol/L，2mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L 的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉孵育C2C12細(xì)胞24h，MTS法檢測細(xì)胞生存率。

1.2.3 Western blot 配置RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑Na3VO41mmol/L，NaF0.5mmol/L，PIC1μmol/L和 PMSF 200 μmol/L）。棄去細(xì)胞上清液，用冷 1×PBS緩沖液洗兩次，用細(xì)頭吸管吸凈，加入RIPA裂解液，置于冰上20 min，并收集。預(yù)冷離心機(jī)至4℃，13 000 r/min，離心 20 min，取上清。將 5×LSB 緩沖液與上清液按1：4的比例混勻，金屬浴100℃煮10min。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用3%牛血清白蛋白封閉2 h，孵育一抗4℃過夜，二抗使用偶聯(lián)辣根過氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG孵育2 h，條帶用ECL發(fā)光液孵育并用曝光機(jī)檢測。β-actin為內(nèi)參，Image J軟件定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism6統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以mean±SEM表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉對C2C12細(xì)胞活力的影響 分別用不同濃度的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉孵育C2C12細(xì)胞24h。如圖1所示，1mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L 的乙酸鈉處理后細(xì)胞存活率分別為對照組的100.73%±0.07、98.76%±0.03、101.12%±0.05、107.15%±0.05 和103.11%±0.08倍，與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異，說明乙酸鈉在濃度為1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8mmol/L和16mmol/L時對C2C12細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性；1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L的丙酸鈉處理后細(xì)胞存活率分別為對照組的102.88%±0.03、1 04.13% ±0.02、102.71% ±0.06、99.55% ±0.02 和101.23%±0.02倍，與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異，說明丙酸鈉在濃度為1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L和16 mmol/L時對C2C12細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性；1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L的丁酸鈉處理后細(xì)胞存活率分別為對照組的104.05% ±0.05、102.18% ±0.02、101.91% ±0.05、106.60%±0.03和95.38%±0.03倍，與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異，說明丁酸鈉在濃度為1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L和16 mmol/L時對 C2C12細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性，均可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉對C2C12細(xì)胞生存率的影響Fig 1 Effects of different concentrations of sodium acetate,sodium propionateandsodiumbutyrateontheviabilityofC2C12cells

2.2 乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉對AMPK的影響 用不同濃度（0 mmol/L，1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L）的乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉分別孵育 C2C12細(xì)胞 24 h，Western blot檢測 AMPK磷酸化和總蛋白。以橫坐標(biāo)為乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉的濃度，以縱坐標(biāo)為pAMPK/β-actin的比值，如圖2所示，與對照組相比，1 mmol/L和4 mmol/L乙酸鈉孵育后，AMPK磷酸化水平分別是對照組的1.34±0.08倍（P<0.01） 和 1.30±0.08 倍（P<0.01），AMPK總蛋白沒有變化；4 mmol/L丙酸鈉孵育后，AMPK磷酸化水平是對照組的1.68±0.30倍（P<0.05），AMPK總蛋白沒有變化；4 mmol/L，8 mmol/L和16 mmol/L丁酸鈉孵育后，AMPK磷酸化水平分別是對照組的 1.52±0.11 倍（P<0.01）、1.34±0.10 倍（P<0.01）和 1.53±0.20倍（P<0.05），AMPK 總蛋白沒有變化，提示乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉均激活A(yù)MPK且不影響AMPK總蛋白。

圖2 C2C12細(xì)胞中AMPK pT172的磷酸化水平Fig 2 The phosphrylation of AMPK pT172 in C2C12 cells

3 討論

AMPK是機(jī)體維持代謝平衡所需分子，其活化在糖脂代謝方面發(fā)揮重要作用[9]。AMPK在真核生物中普遍表達(dá)，其α亞基起催化作用，主要代表AMPK的活性，β和γ亞基在維持三聚體穩(wěn)定性和作用底物特異性方面起重要作用，每個亞單位都存在 2~3 種基因所編碼的異構(gòu)體（α1，α2、β1，β2、γ1，γ2，γ3）[10]。α 亞單位中的 8 個位點(diǎn)（蘇氨酸 172、蘇氨酸258和絲氨酸485等）均可被磷酸化，其中蘇氨酸172位點(diǎn)的磷酸化對AMPK活性起重要作用，該位點(diǎn)的磷酸化提示AMPK的活化。AMPK活性主要受細(xì)胞中AMP/ATP比值的調(diào)節(jié)，生理情況下，為了維持基本的代謝需要，細(xì)胞中維持著高濃度的ATP水平，運(yùn)動時肌肉收縮，骨骼肌能量消耗增加可達(dá)100倍，ATP轉(zhuǎn)化為 AMP，AMP/ATP比值升高，AMPK被激活，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[4,11-12]。

腸道菌群寄居于人胃腸道內(nèi)，它們能抵御感染和降低自體免疫疾病的患病風(fēng)險，還能影響體重和消化能力[13]。將健康人的腸道微生物群轉(zhuǎn)移到代謝綜合征患者腸道內(nèi)可提高代謝綜合征患者的胰島素敏感性[7]。丁酸菌等腸道微生物群發(fā)酵食物時由于缺乏合適的酶而不完全水解，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，進(jìn)入體循環(huán)直接影響外周組織的代謝和功能[14-15]。在肥胖小鼠中，補(bǔ)充丁酸鹽可增加胰島素敏感性并減輕體質(zhì)量，可見短鏈脂肪酸在糖尿病等代謝疾病中發(fā)揮作用[16]。在肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中，乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉通過激活A(yù)MPK防止高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠骨骼肌細(xì)胞中，乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉均激活A(yù)MPK，提示短鏈脂肪酸可通過AMPK信號通路促進(jìn)骨骼肌葡萄糖攝取。有文獻(xiàn)報道，GPR41（G 蛋白偶聯(lián)受體 41）和 GPR43（G 蛋白偶聯(lián)受體43）是短鏈脂肪酸的受體，分布于骨骼肌和肝臟等器官中，短鏈脂肪酸可能通過GPR41/GPR43介導(dǎo)的機(jī)制增加骨骼肌葡萄糖攝取[7]。有研究指出，丁酸改善大鼠骨骼肌線粒體功能，促進(jìn)PGC-1α（過氧化物酶體增殖物激活受體C輔助激活因子-1α）的表達(dá)，在能量代謝中發(fā)揮作用[17]，而增加PGC-1α的表達(dá)可激活小鼠骨骼肌AMPK，推測丁酸可能通過PGC-1α途徑激活A(yù)MPK[17]。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸磷酸化小鼠骨骼肌細(xì)胞AMPK，有助于進(jìn)一步研究其改善胰島素抵抗的詳細(xì)機(jī)制，以及通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善胰島素抵抗。