高效液相色譜法同時測定骨密度片中6種大豆異黃酮和淫羊藿苷的含量

高洋，馬方圓，禹珊珊，趙倩倩，金向群※，劉霞

（1.吉林大學藥學院，長春 130020；2.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春 130118）

骨密度片是以大豆、淫羊藿、骨碎補等為配伍研制出的擬用于治療骨質(zhì)疏松的一種中成藥。大豆中的大豆異黃酮可用于防治骨質(zhì)疏松[1]，既能促進人骨的形成又能抑制骨的吸收，對于維持髖部骨礦物質(zhì)密度以及全身的骨礦含量具有適當作用[2]。張建東[3]使用大豆異黃酮對去勢大鼠進行了研究，實驗結(jié)果顯示，大豆異黃酮對于骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度具有明顯的提高作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷對破骨細胞的生成具有抑制作用，抗骨質(zhì)疏松的作用明顯[4]。骨碎補是水龍骨科植物槲蕨的干燥根莖，骨碎補具有補肝腎、強筋骨的功效[5]。實驗室通過大量實驗研究，將3 種藥材制成了具有抗骨質(zhì)疏松功能的骨密度片。通過藥理活性實驗研究，該制劑具有抗骨質(zhì)疏松的功效[6]。為控制該制劑質(zhì)量，簡單方便的含量測定方法亟待解決。分別測定6 種大豆異黃酮[7]和淫羊藿苷[8]含量的方法已有報道，但同時測定這7 種成分的方法仍未見報道。本試驗建立了可同時測定增加骨密度片中7 種有效成分（大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷）含量的簡單方便方法，為控制骨密度片的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

1525-2489 高效液相色譜儀（Waters公司）；AB204-N 電子分析天平（上海方瑞儀器有限公司）；5TC-C18（4.6 mm×250 mm，5m）（Agilent 公司）；US-10D 數(shù)控超聲波清洗器（中國科技儀器設(shè)備廠）。

1.2 材料與試劑

供試樣品 骨密度片由吉林大學藥學院藥劑實驗室自制（批號：20160612）

大豆苷標準品（批號：14100905）、染料木苷標準品（批號：14060511）、染料木素標準品（批號：1604141）、淫羊藿苷標準品（批號：15081811）（北京世紀奧科生物生物技術(shù)有限公司）；黃豆黃苷標準品（批號：151224）、大豆苷元標準品（批號：151209）、黃豆黃素標準品（批號：160107）（北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司）；色譜純甲醇、乙腈（美國費世爾公司）；磷酸為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合標準品溶液的制備 分別精密稱取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元，黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷（經(jīng)五氧化二磷干燥）標準品適量，制備成0.3600mg/mL、0.0407mg/mL、0.3570mg/mL、0.4050mg/mL、0.080 7 mg/mL、0.075 4 mg/mL、0.200 0 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品骨密度片（批號：20160612）20 片，除去薄膜衣層后粉碎，混合均勻稱，取粉末4.05g放置在燒杯中，精密加入50mL80%甲醇。放置30 min 后進行超聲（30 min，30 ℃），放至室溫，過濾。60℃將續(xù)濾液減壓濃縮，用50mL20%乙醇溶解后，上柱〔預先處理過的D101大孔樹脂柱（1.5 cm×20 cm）〕，分別用100 mL 無水乙醇、250 mL 超純水、100 mL 無水乙醇進行洗脫，再用100 mL20%乙醇洗脫后收集洗脫液，蒸干，將殘余物用80%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，80%甲醇定容，混勻，0.22m 微孔濾膜濾過，濾液為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按骨密度片的處方比例分別配制不含大豆和淫羊藿的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備成2 種陰性樣品溶液。

2.2.4 測定

圖1 混合對照品（A）、樣品（B）、缺大豆陰性樣品（C）、缺淫羊藿陰性樣品（D）的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixture of reference substances(A),sample(B),negative sample without Soybean(C),negative sample without Epimedium(D)

2.3 標準曲線

精密吸取混合標準品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8 mL、1.0 mL 分別置于10 mL 容量瓶中，用洗滌液〔A（V）∶B（V）=88∶12〕定容至10 mL，配制出不同濃度的混合標準品溶液備用。分別精確吸取各濃度的混合標準品溶液10L，注入色譜儀，以X軸為標準品濃度、Y 軸為峰面積積分值做回歸曲線。得到大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷回歸方程，見表1。

表1 線性方程、相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear equation、correlation coefficient

結(jié)果表明，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷分別在7.200g/mL～36.000g/mL、0.814g/mL～4.070g/mL、7.140g/mL～35.700g/mL、8.040g/mL～40.200g/mL、1.620g/mL～8.100g/mL、1.500g/mL～ 7.500g/mL、0.040g/mL～0.240g/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗

2.5 穩(wěn)定性試驗

2.6 重復性試驗

精密稱取20161116批次樣品6 份，除去薄膜衣層，研細，精密稱定，采用“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10L 進樣，進行含量測定。結(jié)果表明，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷的含量均值分別為0.362mg/g、0.0382 mg/g、0.324 0 mg/g、0.308 0 mg/g、0.063 4 mg/g、0.079 6mg/g和0.8020mg/g，RSD分別0.80%、0.52%、0.46%、0.48%、0.50%、0.67%和0.33%。表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

分別稱取已知含量的樣品粉末6 份，每份1.0g，每份分別加入適量大豆苷，黃豆黃苷，染料木苷，大豆苷元，黃豆黃素，染料木素和淫羊藿苷對照品溶液,按照“2.2.2”項下方法進行處理，進樣測定各成分的含量，并計算回收率。結(jié)果，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷平均回收率（n=6）分別為98.54%、98.42%、98.42%、98.62%、98.42%、98.23%和98.24%；RSD 分別為0.54%、0.56%、0.89%、1.01%、0.86%、0.62%和0.56%。結(jié)果表明，各組分的平均加樣回收率均在95%～105%之間，加樣回收率良好。見表1。

表1 回收率測結(jié)果Tab 1 Recovery results

續(xù)表1

2.8 樣品含量測定

分別取批號為201611116、20161120、20161124 3批樣品，每批樣品取3 份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣，進樣量為10L，對大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷峰面積進行記錄，并計算各個成分的含量。見表2。

表2 樣品含量測定Tab 2 Assaying of sample （mg/g）

3 討論

3.1 流動相的選擇

根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015 版，淫羊藿苷采用乙腈-水（30∶70）為流動相，由于樣品種類繁多，并不能使7 種樣品達到分離效果。本試驗還嘗試了水-磷酸：甲醇為流動相，結(jié)果淫羊藿苷與染料木素也無法分離。為保證分離效果好，最后根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015 版大豆異黃含量測定使用的水-磷酸（pH=3）：乙腈作為流動相，并對流動相比例進行了調(diào)整。

3.2 波長的選擇

根據(jù)全波長掃描，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷最大吸收波長分別為250 nm、257 nm、260nm、249 nm、260 nm、261 nm、270nm，為保證7 種成分均有較好的吸收，選用260nm作為測定波長。

3.3 供試品的制備

樣品中成分較多，傳統(tǒng)測定大豆異黃酮和淫羊藿苷的方法不能達到理想的分離度，為了除去部分雜質(zhì)，達到基線分離，采用D101 大孔樹脂對樣品進行洗脫處理，并對水及20%、30%、40%乙醇洗脫情況進行了考察，在使用20%乙醇進行洗脫后，樣品的分離度最好，符合含量測定要求，并對含量的影響很小（加樣回收率符合要求）。故選擇20%乙醇溶液作為洗脫劑，進行洗脫，棄去洗脫液，再用無水乙醇洗脫，收集無水乙醇洗脫液，蒸干，用80%甲醇定容，作為供試品溶液。

4 小結(jié)

本試驗建立了同時測定骨密度片中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷7 種有效成分含量的方法，為骨密度片的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。同時也為其他含有大豆和淫羊藿藥材的中藥制劑質(zhì)量標準的建立提供參考依據(jù)。