腎復康片對陽離子化牛血清白蛋白誘發(fā)大鼠膜性腎小球腎炎的作用研究

倪賽宏，袁家升，傅水蓮，柳洪峰，何麗明，劉同彥，陳志國，鄒麗園，王丹妮，洪鐵※

（1.吉林大學藥學院藥理教研室，長春 130021；2.吉林敖東集團力源制藥股份有限公司，吉林 延邊 133700；3.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，長春 130118；4.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院藥劑科，長春 130033）

膜性腎小球腎炎（Membranous glomerulo-nephritis，MGN）是腎病綜合征的成因之一，其病理特征是腎小球基底膜增厚和免疫復合物在上皮下沉積[1]。膜性腎小球腎炎的臨床表現(xiàn)為全身水腫及無癥狀蛋白尿，約有45%膜性腎小球腎炎患者最終會導致終末期腎病[2]。臨床治療上主要以免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素治療為主，但由于其毒副作用較大，限制了臨床的應(yīng)用[3]。因此，尋求中醫(yī)中藥治療膜性腎小球腎炎的有效藥物具有重要意義。

腎復康片由土茯苓、槐花、白茅根、益母草、藿香藥物組成，具有清熱利尿、益腎化濁的功能，臨床上用于治療熱淋澀痛、急性腎炎水腫、慢性腎炎急性發(fā)作。本研究通過尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白（CBSA），誘發(fā)大鼠膜性腎小球腎炎，觀察腎復康片對大鼠膜性腎小球腎炎的治療作用。

1 材料及儀器

1.1 動物

雄性Wistar 大鼠73 只，體重180～200 g，遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2015-0001。放于實驗室（環(huán)境溫度22 ℃、相對濕度40%）適應(yīng)環(huán)境。

1.2 藥物及試劑

腎復康片（吉林敖東集團力源制藥股份有限公司，批號：170105）；腎炎康復片（批號：HP17097，天津同仁堂集團股份有限公司）；牛血清白蛋白第5 組分（Sigma公司）；無水乙二胺（EDA）（天津市富宇精細化工有限公司，批號：20160712）；碳化二亞胺（EDC）（上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司，批號：GHBNN-FJ）；弗氏不完全佐劑（北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司，批號：230R001170）；BCA試劑盒（大連美侖生物技術(shù)有限公司, 批號：MA0082-Sep-21B）；肌酐試劑盒（批號：20171020）、尿素氮試劑盒（批號：20171025）、白蛋白試劑盒（批號：20171022）（南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3 儀器

代謝籠（江蘇賽昂斯生物科技有限公司）；T-100 天平〔美國雙杰兄弟（集團）有限公司〕；3-18K離心機（德國Sigma 公司）；微孔板分光光度計（美國伯騰儀器有限公司）。

2 方法

2.1 陽離子化牛血清白蛋白的制備

采用改良Border 法[4]制備。取67 mL EDA 加入500 mL 雙蒸水中并混勻，緩慢加入6 mol/L 的鹽酸350mL，調(diào)節(jié)pH 至4.75，保持溫度在25 ℃；取牛血清白蛋白（BSA）5 g溶于25 mL雙蒸水中，緩慢加入EDA溶液中，攪拌后，加入1.8 g EDC，持續(xù)攪拌2 h 并維持25 ℃，保持pH4.75，加入4 mol/L（pH4.75）醋酸鹽緩沖液30 mL，終止反應(yīng)，即得陽離子化牛血清白蛋白（CBSA）溶液。4 ℃雙蒸水中透析72 h（3～5 h 更換1 次雙蒸水），經(jīng)冷凍干燥機充分冷凍干燥，即得到C-BSA凍干粉劑，密封保存于 80℃冰箱內(nèi)。注射前用0.01 mol/L pH 7.4 磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成溶液。

2.2 C-BSA誘發(fā)大鼠膜性腎小球腎炎模型的建立

73 只Wistar 雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機取8 只作為正常對照組，其余65 只統(tǒng)一進行造模。預(yù)免疫：C-BSA100 mg，溶于3.75 mL PBS中，加入26.25 mL弗氏不完全佐劑充分混合乳化，除正常組外，其余各組于每只大鼠的雙側(cè)腋下、背部及腹股溝多個位置皮下注射，每只大鼠注射0.3 mL，每點注射不超過0.05 mL，隔日1 次，1 周3 次。預(yù)免疫1 周后，開始正式免疫，大鼠隔日1 次尾靜脈注射C-BSA 3.5 mg/只（注射前用1 mL PBS 配成溶液），每周注射3 次，共計4 周。造模28d后測定大鼠24h尿蛋白量為139.74mg（P＜0.01），證實陽離子化牛血清白蛋白誘導大鼠腎炎模型成功。

2.3 分組及給藥

免疫結(jié)束后按尿蛋白高低將大鼠分為5 組并編號，即模型對照組、陽性藥組（0.648 g/kg）、腎復康片高劑量組（1.0 g/kg）、腎復康片中劑量組（0.50 g/kg）、腎復康片低劑量組（0.25 g/kg）。每天灌胃給藥1 次，正常對照組及模型對照組給予同體積蒸餾水，連續(xù)給藥6周。

2.4 測定指標

2.4.1 24 h 尿蛋白量 分別于造模結(jié)束第0 周、第2周、第4 周，第6 周將大鼠放置于代謝籠中，收集大鼠的24 h 尿液，并記錄尿量，測定24 h 尿蛋白量。

2.4.2 生化指標 實驗結(jié)束后腹主動脈取血，測定血清中血肌酐（Scr），尿素氮（BUN），總蛋白（TP），白蛋白（Alb）含量，具體方法按試劑盒標示方法進行。

2.4.3 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腎組織病理變化

每只大鼠摘取右側(cè)腎臟，立即投入10%的多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，5m連續(xù)切片，經(jīng)HE染色，光學顯微鏡下觀察大鼠腎組織病理變化情況。

3 統(tǒng)計

4 結(jié)果

4.1 腎復康片對24h尿蛋白量的影響

給藥后第2 周、第4 周、第6 周，模型組尿蛋白量與正常對照組相比有明顯差異（P ＜0.01）；給藥后第2 周，腎復康片高劑量組與模型對照組相比有明顯差異（P＜0.05），其他各給藥組均有明顯的降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義；給藥后第4 周，腎復康片高劑量組與模型對照組相比有明顯差異（P＜0.05），陽性藥組、腎復康片中劑量組均有降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義；給藥后第6 周，腎復康片高劑量組與模型對照組相比有明顯差異（P＜0.01），腎復康片中劑量組有降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 腎復康片對陽離子化牛血清白蛋白誘發(fā)大鼠膜性腎小球腎炎24 h 尿蛋白量影響Table 1 Effect of Shenfukang tablet on 24h urine protein levels on membrane glomerulo-nephritis-induced by cationic bovine serum albumin in rats

4.2 生化指標檢測

血清肌酐含量模型對照組與正常對照組相比有明顯差異（P ＜0.01），陽性藥組、腎復康片高劑量組、中劑量組與模型對照組相比有明顯差異（P ＜0.01），腎復康片低劑量組與模型對照組相比有明顯差異（P ＜0.05）；尿素氮含量模型對照組與正常對照組相比有明顯差異（P ＜0.01），腎復康片高劑量組與模型對照組相比有明顯差異（P ＜0.01）；血清中總蛋白含量模型對照組與正常對照組相比有明顯差異（P ＜0.01），腎復康片高劑量組與模型組相比有明顯差異（P＜0.05），其他給藥組均有增加趨勢，但無統(tǒng)計學意義；白蛋白含量模型對照組與正常對照組相比有明顯差異（P ＜0.01），腎復康片高劑量組與模型對照組相比有明顯差異（P＜0.01），陽性藥組、腎復康片中劑量組與模型對照組相比有明顯差異（P ＜0.05）。見表2、見表3。

表2 腎復康片對膜性腎小球腎炎大鼠血清中肌酐、尿素氮影響Table 2 Effect of Shenfukang tablet on Scr and BUN levels in serum on membrane glomerulo-nephritis-induced by cationic bovine serum albumin in rats

表3 腎復康片對膜性腎小球腎炎大鼠血清中總蛋白、白蛋白影響Table 3 Effect of Shenfukang tablet on TP and Alb levels in serum on membrane glomerulo-nephritis-induced by cationic bovine serum albumin in rats

4.3 病理檢查結(jié)果

病理結(jié)果顯示，正常對照組大鼠腎小球形態(tài)基本正常；模型對照組大鼠腎小球明顯腫脹，固有細胞明顯增多，基底膜增厚；與模型對照組相比，腎復康片高劑量組、中劑量組大鼠的腎小球腫脹減輕，腎小球固有細胞增多、基底膜增厚程度明顯減輕。見圖1。

圖1 腎復康片對膜性腎小球腎炎大鼠病理變化的影響（HE，400×）Figure 1 Effect of Shenfukang tablet on pathological changes on membrane glomerulo-nephritis-induced by cationic bovine serum albumin in rats

5 討論

膜性腎小球腎炎[5]是免疫球蛋白和補體成分沉積在腎小球毛細血管壁上皮層引起的一種抗體介導的自身免疫性疾病[6]。抗原抗體免疫復合物引起的免疫損傷是膜性腎小球腎炎的主要發(fā)病機理[7]。C-BSA 誘發(fā)膜性腎小球腎炎大鼠模型的原理是C-BSA 帶有正電荷，在富含負電荷的腎小球基膜上結(jié)合而沉積在基膜上，吸引血液循環(huán)的相應(yīng)抗體，導致腎臟局部免疫復合物的形成[8]。與其他模型如毒性物質(zhì)引起的腎炎模型比較，C-BSA誘發(fā)的腎炎模型的發(fā)病機理及病理過程與臨床常見的腎小球腎炎更為相似，對于研究腎小球腎炎病變、生理生化變化、評價藥物作用療效等均具有一定意義[9]。

大量蛋白尿和低蛋白血癥是腎臟病變的標志，蛋白尿排出增加使腎小球損傷逐漸加重，蛋白尿引起的腎小球病變可導致腎小球濾過屏障喪失，腎小球?qū)ρ獫{中的蛋白質(zhì)通透性增加，使血漿蛋白從腎小球毛細血管壁濾過，血漿蛋白自尿液中丟失，從而導致腎小球硬化，病情不斷加重[10]，降低蛋白尿、延緩腎臟疾病惡化是藥物治療的主要指標之一[11]。本實驗結(jié)果顯示，給藥后腎復康片高劑量組降低大鼠24 h 尿蛋白的作用最明顯，而模型對照組尿蛋白依然嚴重；給藥后腎復康片高、中劑量組血清中TP、Alb 含量增加，而模型對照組TP、Alb 含量明顯降低，表明腎復康片能減少膜性腎小球腎炎大鼠尿蛋白，增加TP、Alb 含量，對大鼠膜性腎小球腎炎有改善作用。

血清中Scr 和BUN 分別為含氮有機物和蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物，在腎功能正常的情況下，這些小分子物質(zhì)從腎小球濾出，當腎小球濾過功能損傷時，血中Scr和BUN含量增高[12]。所以在臨床上，Scr 和BUN含量可以反映腎小球的濾過功能，常用作判斷腎功能的重要指標。給藥后，腎復康片高、中、低劑量組可降低血中Scr的含量；腎復康片高、中劑量組可降低BUN 含量。研究結(jié)果表明，腎復康片對陽離子化牛血清白蛋白誘發(fā)大鼠膜性腎小球腎炎有良好的治療作用。