水貂犬瘟熱活疫苗與水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗制備及其聯(lián)合免疫效果研究

羅國良，王振軍，馮二凱，易立，郭利，程悅寧※，程世鵬，王守富，王宏正，張洪亮

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130118；3.長(zhǎng)春西諾生物科技有限公司，長(zhǎng)春 130012）

水貂犬瘟熱是引起水貂以雙相熱、白細(xì)胞減少、鼻炎和粘膜炎為特征的傳染病[1]。水貂病毒性腸炎是以出血和壞死、急劇下痢、白細(xì)胞高度減少為特征的急性病毒性傳染病[2]。2 種疾病均有較高的發(fā)病率和死亡率，是世界公認(rèn)的危害水貂養(yǎng)殖業(yè)較嚴(yán)重的傳染病[3]，一旦發(fā)生，損失巨大。疫苗免疫接種是目前預(yù)防這2種疾病的最主要的方法。目前，我國防治這2 種疾病的疫苗有水貂犬瘟熱活疫苗、水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗以及水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗。聯(lián)苗具有“一針多防”、減少免疫次數(shù)、提高接種效率等優(yōu)點(diǎn)，聯(lián)苗方式一般為活疫苗與活疫苗聯(lián)用或者為滅活疫苗與滅活疫苗聯(lián)用，而活疫苗與滅活疫苗聯(lián)用的情況在國內(nèi)較少采用，在國外犬用多聯(lián)疫苗中較多采用滅活疫苗組分稀釋活疫苗組分的聯(lián)用方法，該方法有效地實(shí)現(xiàn)了聯(lián)苗中各組分的優(yōu)勢(shì)組合。

本研究采用新型的制苗工藝，滅活疫苗采用新型滅活工藝，通過接種細(xì)胞和免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)2 種疫苗聯(lián)合免疫的效力，為進(jìn)一步研制開發(fā)水貂犬瘟熱活疫苗與細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗二聯(lián)苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細(xì)胞 水貂犬瘟熱CDV3-CL 株、水貂細(xì)小病毒MEVB株（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動(dòng)物病原與免疫團(tuán)隊(duì)保存）；F81 細(xì)胞、Vero細(xì)胞（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫提供）。

1.1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA消化液（Corning 公司）；2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA）（Sigma-aldrich公司）；甲醛（國藥集團(tuán)）；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 水貂購自農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)白山野生生物資源重點(diǎn)野外科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，2～3月齡，雌、雄隨機(jī)，體況健康且未免疫水貂犬瘟熱疫苗和水貂細(xì)小病毒性腸炎疫苗，免疫前經(jīng)采血檢測(cè)，犬瘟熱病毒中和抗體和水貂細(xì)小病毒HI 抗體均為陰性。

1.2 方法

1.2.1 水貂犬瘟熱活疫苗制備與檢驗(yàn) 將CDV3-CL株用含MEM的細(xì)胞維持液作適當(dāng)稀釋，按5%的比例接種于長(zhǎng)成良好單層的Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，37 ℃吸附1 h，加入含2%新生牛血清的細(xì)胞維持液，35 ℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，細(xì)胞病變（CPE）達(dá)到80%以上時(shí)收獲，20℃凍結(jié)，凍融后即為半成品。取樣檢驗(yàn)無菌合格且病毒含量≥105.70TCID50/mL 的半成品作為制苗用病毒液。將檢驗(yàn)合格的病毒液與明膠蔗糖凍干保護(hù)劑按適宜比例混合，同時(shí)用0.1 mol/L 的NaHCO3 調(diào)pH 值7.4，充分混合，定量分裝至100 mL玻璃凍干瓶?jī)?nèi)，凍干機(jī)凍干，凍干后軋蓋。按以上方法制備3 批疫苗，進(jìn)行性狀、無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、真空度、水分測(cè)定以及效檢和安檢。

1.2.2 水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗制備與檢驗(yàn) 將MEVB 株按1%的比例接種于F81 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)瓶中。35 ℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞CPE達(dá)到80%以上時(shí)收獲，20℃凍結(jié)，凍融后即成半成品，取樣檢驗(yàn)無菌合格且病毒含量≥106.00TCID50/mL的半成品作為制苗用病毒液。將病毒液用0.002 mol/L 二乙烯亞胺（BEI）滅活24 h，滅活后加入BEI 使用量的10%的1 mol/L 硫代硫酸鈉中和BEI。滅活檢驗(yàn)合格后，按病毒液∶氫氧化鋁膠=9∶1 的比例制成水貂細(xì)小病毒滅活疫苗。按以上方法制備3批疫苗，進(jìn)行性狀、裝量、無菌、效檢和安檢。

1.2.3 水貂犬瘟熱活疫苗與細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗聯(lián)合及聯(lián)合后犬瘟熱病毒含量的測(cè)定 在相同頭份數(shù)情況下，使用專用稀釋針頭將水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗吸入犬瘟熱活疫苗凍干瓶?jī)?nèi)，將該狀態(tài)下產(chǎn)品組合稱之為水貂犬瘟熱、腸炎聯(lián)合疫苗（以下簡(jiǎn)稱聯(lián)合疫苗）。

將聯(lián)合疫苗與同批次專用稀釋液稀釋的對(duì)照疫苗，分別置25 ℃條件下5 h，每小時(shí)取樣1 次，將樣品10 倍系列稀釋，接種長(zhǎng)成單層的Vero 細(xì)胞培養(yǎng)板，測(cè)定兩種疫苗中犬瘟熱病毒含量。

1.2.4 聯(lián)合疫苗免疫試驗(yàn) 犬瘟熱病毒中和抗體和細(xì)小病毒HI抗體均為陰性的水貂30 只，分為3 組，每組10 只。聯(lián)合疫苗組免疫聯(lián)合疫苗，每只水貂免疫各1頭份，犬瘟單苗組免疫水貂犬瘟熱活疫苗，每只水貂免疫1 頭份，腸炎單苗組免疫水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗，每只水貂免疫1 頭份。免疫后21 d，采血分離血清，聯(lián)合疫苗組測(cè)定犬瘟熱病毒中和抗體和細(xì)小病毒HI 抗體，犬瘟疫苗組測(cè)定犬瘟熱病毒中和抗體，腸炎苗組測(cè)定水貂細(xì)小病毒HI 抗體。

2 結(jié)果

2.1 水貂犬瘟熱活疫苗制備與檢驗(yàn)結(jié)果

3 批水貂犬瘟熱活疫苗半成品均合格，病毒含量均在105.70TCID50/mL 標(biāo)準(zhǔn)之上，且無明顯的批間差異。成品進(jìn)行性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)、剩余水分和真空度測(cè)定結(jié)果均符合現(xiàn)行《中國獸藥典》規(guī)定。3 批成品對(duì)水貂安全，病毒含量為104.50～104.70TCID50/mL，均符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（≥103.50TCID50/mL）。見表1、表2。

表1 水貂犬瘟熱活疫苗半成品檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of semi-finished product test of mink distemper vaccine,live

表2 水貂犬瘟熱活疫苗成品安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Safety test and efficacy test results of mink distemper vaccine,live

2.2 水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗制備與檢驗(yàn)結(jié)果

3 批水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗半成品無菌檢驗(yàn)與滅活檢驗(yàn)均合格，病毒含量為106.67～106.80TCID50/mL，均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（≥106.00TCID50/mL）。

成品進(jìn)行檢驗(yàn)，性狀、裝量、無菌檢驗(yàn)結(jié)果均符合要求，對(duì)水貂安全，HI 抗體效價(jià)為1∶128～1∶1 024，均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（≥1∶32）。見表3、表4。

表3 水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗半成品檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of semi-finished product test of mink parvovirus enteritis inactivated vaccine

表4 水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗成品安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Safety and efficacy test results of mink parvovirus enteritis inactivated vaccine

2.3 聯(lián)合疫苗的犬瘟熱病毒含量測(cè)定

將聯(lián)合疫苗組、犬瘟單苗組樣品25 ℃條件下不同時(shí)間取樣，測(cè)定的犬瘟熱病毒含量0～5 h 而略有下降（均下降100.30），但相同時(shí)間下兩者的病毒含量無明顯差異。見表5。

表5 水貂犬瘟熱活疫苗與細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗聯(lián)合后病毒含量結(jié)果Table 5 The TCID50 result of mink distemper vaccine live combined with parvovirus enteritis inactivated vaccine

續(xù)表5

2.4 聯(lián)合疫苗動(dòng)物免疫試驗(yàn)

聯(lián)合疫苗組樣品產(chǎn)生的犬瘟熱中和抗體與犬瘟單苗組相比，兩者無明顯差異；聯(lián)合疫苗組產(chǎn)生的水貂細(xì)小病毒HI 抗體與腸炎單苗組相比，兩者亦無明顯差異。

表6 聯(lián)合疫苗免疫抗體結(jié)果

3 結(jié)論與分析

目前，采用滅活疫苗稀釋活疫苗實(shí)現(xiàn)聯(lián)苗的方式在國外犬用苗上較常用，如法國梅理亞生產(chǎn)的犬瘟熱、腺病毒病、細(xì)小病毒病、副流感病毒2 型呼吸道感染癥4 聯(lián)活疫苗-犬鉤端螺旋體病、黃疸鉤端螺旋體病2 價(jià)滅活疫苗；碩騰公司的犬瘟熱、腺病毒2 型、副流感、細(xì)小病毒四聯(lián)活疫苗-犬鉤端螺旋體病（犬型、黃疸出血型）2 價(jià)滅活疫苗-犬冠狀病毒病滅活疫苗。能夠?qū)崿F(xiàn)滅活疫苗與活疫苗聯(lián)用的前提條件是滅活疫苗與活疫苗聯(lián)合后對(duì)活疫苗中的病毒無滅活作用，兩者一起免疫后不降低各自的免疫效果。

本研究中，在水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗的制苗過程中，為了降低滅活劑的殘留，優(yōu)化了水貂細(xì)小病毒性腸炎的滅活工藝，采用BEI進(jìn)行滅活，殘留的BEI采用硫代硫酸鈉進(jìn)行中和，經(jīng)檢驗(yàn)水貂細(xì)小病毒滅活完全。半成品和成品的各項(xiàng)檢驗(yàn)指標(biāo)均符合要求，成品效力檢測(cè)抗體水平無明顯差異，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。

犬瘟熱半成品、成品的檢測(cè)指標(biāo)亦表明，采用100mL 玻璃凍干瓶?jī)龈傻娜翢峄钜呙绲纳a(chǎn)工藝穩(wěn)定，成品病毒含量無明顯差異（104.50～104.70TCID50/mL）；滅活疫苗組分對(duì)犬瘟熱病毒無明顯影響；犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒抗體水平與單苗相比均無明顯影響。