化瘀生新合劑制備工藝優(yōu)化△

楊小催，郭彩娥，沈祖泓

清遠(yuǎn)市中醫(yī)院，廣東 清遠(yuǎn) 511500

化瘀生新合劑處方來源于清遠(yuǎn)市中醫(yī)院婦產(chǎn)科章青英教授臨床經(jīng)驗方“產(chǎn)后方”，該方由黨參、黃芪、當(dāng)歸、川芎等8味藥材組成，具有益氣固澀、祛瘀止血、溫經(jīng)止痛之功能，在院內(nèi)臨床使用十多年，用于產(chǎn)后子宮復(fù)舊及瘀血不盡、沖任不固所致的產(chǎn)后惡露不絕，療效明確，可顯著降低宮底高度，促進(jìn)惡露排出，提高子宮復(fù)舊效果。該處方原為湯劑內(nèi)服，臨床療效較好，但存在煎煮、攜帶、使用不方便的缺點(diǎn)，結(jié)合預(yù)試驗結(jié)果和醫(yī)院實際條件，擬制備成合劑，其具有起效快，服用和攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，適合病人服用，可以滿足臨床用藥和制劑生產(chǎn)需要。

通過文獻(xiàn)資料研究發(fā)現(xiàn)，方中當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、炮姜發(fā)揮功能的有效成分主要存在于揮發(fā)油和水提取液中，黨參、黃芪等藥材主要為水溶性成分，結(jié)合本處方在臨床運(yùn)用中一直以湯劑入藥有效的現(xiàn)狀，確定提取工藝為當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、炮姜先提取揮發(fā)油[1]，其藥渣再與黨參等四味藥材共同水煎提取。通過正交試驗[2-3]，以君藥黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量以及固形物總質(zhì)量作為評價指標(biāo)，優(yōu)選水提工藝，并對其濃縮工藝和成型工藝進(jìn)行考察，為該制劑的臨床使用、成批生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀；Waters2489紫外監(jiān)測器；瑞士梅特勒METTLER XS205電子分析天平；美國丹佛TP-114型分析天平；DHG-9023A型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備)；電熱恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療設(shè)備)；上海安亭LXJ-11B離心機(jī)。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111920-201203)；乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑為分析純。

所有藥材均購自廣東眾康藥業(yè)有限公司，并經(jīng)檢驗鑒定符合《中華人民共和國藥典》2015版一部各項下規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素篩選揮發(fā)油提取工藝

經(jīng)預(yù)試驗，當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、炮姜含有的揮發(fā)油相對密度與水接近，按照2015版《中華人民共和國藥典》四部220項揮發(fā)油提取乙法進(jìn)行揮發(fā)油的提取。

2.1.1 吸水率 按處方比例，稱取當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、炮姜飲片3份，每份230 g，分別加8倍量的水浸泡，浸泡過夜，至藥材全部浸透，濾過，稱取濕藥材的質(zhì)量，計算藥材吸水率，結(jié)果藥材的平均吸水率為272.61%，為考察加水倍量提供了參考。

2.1.2 浸泡時間 按處方比例，稱取當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、炮姜飲片3份，每份230 g，分別置3000 mL圓底燒瓶，加入8倍量的水浸泡，分別浸泡0、1、2 h后，加熱回流提取揮發(fā)油8 h，記錄揮發(fā)油提取量分別是0.51、0.52、0.51 mL，收油量無顯著差別，因此無需浸泡。

2.1.3 加水量 按處方比例，稱取當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、炮姜飲片共4份，每份230 g，分別置3000 mL圓底燒瓶，分別加入4、6、8、10倍量水，加熱回流提取揮發(fā)油8 h，記錄揮發(fā)油提取量分別為0.44、0.48、0.52、0.51 mL，確定加水量為8倍量。

2.1.4 提取時間 按處方比例，稱取當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、炮姜飲片共3份，每份230 g，分別置3000 mL圓底燒瓶，加入8倍量水，加熱回流提取揮發(fā)油8 h，記錄2、3、4、5、6、7、8 h的揮發(fā)油收集量分別為0.09、0.23、0.37、0.48、0.51、0.51、0.51 mL，確定提取時間為6 h。

2.1.5 揮發(fā)油提取工藝驗證試驗 根據(jù)單因素篩選試驗中確定的各最佳條件進(jìn)行3批試驗驗證。分別按處方比例，稱取當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、炮姜飲片3份，每份230 g，分別置3000 mL圓底燒瓶，加入8倍量水，加熱回流提取6 h，記錄揮發(fā)油的總收集量分別為0.51、0.52、0.52 mL，與優(yōu)選實驗結(jié)果相近，說明工藝優(yōu)選條件合理，提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.2 水提工藝優(yōu)選

采用正交試驗法，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷(以下簡稱“指標(biāo)成分”)含量和固形物質(zhì)量為考察指標(biāo)，對影響提取效果的加水量、提取時間和提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)選。其因素水平設(shè)計見表1。

表1 因素水平表

2.2.1 樣品制備 按處方比例，稱取飲片9份，每份242 g，當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、炮姜照優(yōu)選工藝提取揮發(fā)油，藥液另存，藥渣與其余四味飲片按正交試驗表L9(3)4安排的方法進(jìn)行提取，濾過，濾液濃縮并定容至250 mL，測定濃縮液中指標(biāo)成分含量和固形物質(zhì)量。

2.2.2 固形物質(zhì)量測定 精密吸取各樣品濃縮液50 mL，置干燥的蒸發(fā)皿中，照浸出物測定法測定，計算固形物質(zhì)量，結(jié)果見表2。

固形物質(zhì)量(g)=[W(g)×V(mL)]/50(mL)

(1)

注：W為50 mL濃縮液中固形物質(zhì)量，V為定容體積。

2.2.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定 色譜條件：XBridgeTMC18色譜柱，流動相為0.2%甲酸-乙腈(88∶12)；柱溫：25 ℃，波長：260 nm。

對照品溶液的配制：取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為87 μg·mL-1的溶液，即得。

供試品溶液的制備：精密吸取濃縮液1 mL，至5 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

陰性對照溶液的制備：取處方中除黃芪外的其他藥材，按供試品溶液制備的方法制得陰性對照溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液(質(zhì)量濃度為87 μg·mL-1)1、2、3、5、7、8 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，分別制得質(zhì)量濃度為8.70、17.40、26.10、43.5、60.9、69.6 μg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液，精密吸取各對照品溶液8 μL進(jìn)樣，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以含量為橫坐標(biāo)，得回歸方程：Y=2.967X-44.31；r=0.999 7。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在進(jìn)樣量69.59～556.71 ng呈良好的線性關(guān)系。

專屬性試驗：吸取上述對照品、供試品及陰性對照溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖1)。結(jié)果顯示，陰性對照圖譜與對照品、供試品圖譜中毛蕊異黃酮葡萄糖苷相應(yīng)的保留時間無其他峰干擾，表明選擇性良好，陰性無干擾。

測定法：分別精密吸取各供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定。

注：A.毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液；B.陰性對照溶液；C.供試品；S.毛蕊異黃酮葡萄糖苷。圖1 化瘀生新合劑HPLC圖

2.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用綜合評分法，結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗結(jié)果

綜合評分=指標(biāo)成分含量i/指標(biāo)成分含量max×50×100%+水溶性固形物質(zhì)量i/水溶性固形物質(zhì)量max×50×100%

(2)

表3 方差分析結(jié)果表

注：F0.1(2，2)=9.00；F0.05(2，2)=19.00。

由直觀分析可見，影響提取效果的因素順序為：提取次數(shù)(C)>加水倍量(A)>提取時間(B)。方差分析結(jié)果表明，因素C和因素A對結(jié)果的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05和P<0.10)，因素B對結(jié)果的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義，綜合考慮生產(chǎn)效率和節(jié)能等各方面因素，確定的優(yōu)選工藝組合為A2B1C2，即藥材飲片提取2次，每次加水8倍量，每次提取1 h。

2.2.5 驗證試驗與結(jié)果 按處方比例，稱取藥材3份，每份242 g，當(dāng)歸、川芎等四味藥材加8倍量水，加熱回流提取6 h，收集揮發(fā)油，藥液保留，藥渣與其他藥材按照上述優(yōu)選的水提工藝條件進(jìn)行提取，濾過，濾液與提油后的藥液合并，濃縮，定容至250 mL，測定指標(biāo)成分的含量和水溶性固形物質(zhì)量，計算綜合評分平均值為97.96，RSD為2.37%，與正交試驗最大綜合評分值接近，說明正交試驗選出的工藝條件合理，工藝條件穩(wěn)定可行。

2.3 濃縮工藝考察

2.3.1 樣品的制備 按提取驗證工藝條件制備提取液兩份(指標(biāo)成分質(zhì)量濃度為3.856 μg·mL-1)，每份9.15 kg，一份置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮(濃縮條件為：-0.085 Mpa，60 ℃)，另一份常壓濃縮，將提取液濃縮至相對密度約1.10(60 ℃)，記錄此時濃縮液的相對密度和質(zhì)量；取樣，測定濃縮液中指標(biāo)成分的含量，計算保留率。結(jié)果見表4。

指標(biāo)成分保留率(%)=

(3)

2.3.2 樣品中指標(biāo)成分的含量測定 提取液供試品溶液的制備：稱取1 g提取液，精密稱定，通過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

濃縮液供試品溶液的制備：精密移取濃縮液1 g，至5 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，結(jié)果見表4。

表4 不同濃縮方法對指標(biāo)成分含量的影響

結(jié)果顯示，減壓濃縮工藝比常壓濃縮工藝的指標(biāo)成分保留率要高，因此確定本品的濃縮方式為減壓濃縮。

2.3.3 濃縮液除雜工藝考察 取相對密度為1.10(60 ℃)的濃縮液兩份，每份約300 mL，一份置離心機(jī)中(5000 r·min-1)離心除雜10 min，取上清液加純化水至400 mL；另一份用200目篩濾過，濾液加水至400 mL。將所述兩種除雜藥液冷藏7 d，觀察沉淀情況，結(jié)果表明，采用離心除雜與濾過除雜所產(chǎn)生的沉淀均可搖散，但采用離心除雜藥液所產(chǎn)生的沉淀物少于采用濾過除雜藥液所產(chǎn)生的沉淀物，因此確定本品濃縮液除雜方法采用5000 r·min-1離心除雜法。

3 成型工藝研究

3.1 矯味劑用量的篩選

本品提取物具有一定的苦、澀味，部分患者服用時難以接受，需添加一定量的甜味劑對藥物進(jìn)行矯味，以增加患者服用的依從性。本制劑選擇具有《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的蔗糖作為甜味劑。試驗以藥液口感為指標(biāo)，取濃縮液412 mL(相當(dāng)于493 g藥材)，加入1.5 g苯甲酸鈉，加熱至沸并保溫30 min，冷藏24 h，濾過，濾液加入50 mL芳香水溶液，攪勻，均分為5份，分別按表5所示加入蔗糖，攪拌使溶解，加入純化水至100 mL，用口嘗之，并觀察藥液外觀。結(jié)果表明，當(dāng)蔗糖加入量為制成量的2.8%時，合劑口感得到改善，確定本品蔗糖用量為制成量的2.8%。

3.2 抑菌劑種類及其用量的選擇

3.2.1 抑菌劑的選擇 本品藥液pH值在4.5左右，可選擇苯甲酸鈉作為抑菌劑。

3.2.2 抑菌劑用量的確定 參照制劑通則中合劑(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0181)[4]第2條使用限量的規(guī)定，即“苯甲酸的用量不得超過0.3%(其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計)”。試驗擬定本品處方中苯甲酸鈉用量為0.2%和0.3%。并按照抑菌效力檢查法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則1121)，測定該抑菌劑加入量樣品的抑菌效力，結(jié)果見表5。

表5 確定處方樣品的抑菌效力測定結(jié)果

結(jié)果表明，本品確定的處方中，苯甲酸鈉用量為制成量的0.3%時，制劑符合制劑通則中合劑使用限量和抑菌效力的規(guī)定。

4 討論

化瘀生新合劑處方是本院婦產(chǎn)科章青英教授根據(jù)產(chǎn)婦多虛多瘀之特點(diǎn)，在“生化湯”[5]基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床多年應(yīng)用總結(jié)出的經(jīng)驗方，兼具生新和化瘀兩方面的作用。古人將生化湯稱為“血塊圣藥”。對產(chǎn)后惡露不下、惡露不絕、腹痛可消塊止痛，促進(jìn)氣血恢復(fù)，加速子宮的收縮，利于機(jī)體的康復(fù)[6]?！堆C論》[7]云：“凡系離經(jīng)之血與榮養(yǎng)周身之血，已暌絕而不合，此血在身，不能加于好血，而反阻新血之化機(jī)。瘀不去，則血不止，舊血不去，新血不生”；《胎產(chǎn)心法》[8]論述：“產(chǎn)后惡露不止，由于產(chǎn)時傷其經(jīng)血，虛損不足，不能攝血或惡血不盡則好血難安，向并而下，日久不止”。

化瘀生新方中黨參益氣補(bǔ)虛，當(dāng)歸補(bǔ)血活血、祛瘀生新，二者為君；黃芪、白術(shù)補(bǔ)中益氣，川芎、桃仁活血行氣，共為臣；益母草活血祛瘀為佐藥；炮姜溫經(jīng)止痛為使。諸藥合用可起到益氣固澀、祛瘀止血、溫經(jīng)止痛之功。

為遵循傳統(tǒng)成方煎煮方法，最大限度保證制劑療效，在提取方法的選擇上，我們采用與該方多年臨床應(yīng)用相同的方法：水提法。又考慮到本處方中部分藥味的揮發(fā)油成分具有調(diào)經(jīng)止痛、抗炎等作用，可提高化瘀血、生新血的療效，促進(jìn)產(chǎn)后恢復(fù)，如當(dāng)歸、川芎中的揮發(fā)油具有鎮(zhèn)痛作用，能促進(jìn)細(xì)胞增殖[9]，能調(diào)節(jié)子宮平滑肌收縮，解除痙攣而達(dá)到調(diào)經(jīng)止痛功能[10]，還具有舒張胃腸及主動脈平滑肌，降低肌張力的作用[10-11]。白術(shù)揮發(fā)油對于胃腸運(yùn)動具有促進(jìn)作用，使小腸推進(jìn)率顯著提高，還能調(diào)節(jié)免疫功能，利膽，鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛[12]；炮姜的揮發(fā)油成分能使周圍血管擴(kuò)張、促進(jìn)血液循環(huán)；能抑制血小板凝集、抗血栓；還具有抗炎、抗凝血作用[13]。因此，本試驗選擇先將當(dāng)歸、白術(shù)、川芎、炮姜提取揮發(fā)油，藥渣與其他藥味再水提的提取方法。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、炮姜提取的混合揮發(fā)油相對密度與水接近，在水中的分散性也較好，將揮發(fā)油與其他藥液混合振搖后，即可較均勻地分散在藥液中，藥液放涼后亦不會上浮，凝聚。且在實際的制劑生產(chǎn)過程中，揮發(fā)油的提取是以揮發(fā)油水溶液的方式收集，油量小，在水中的分散較好。故本制劑中的揮發(fā)油在制劑定容前與其他藥液混合，攪勻即可，無需另外添加表面活性劑等其他增溶劑。