基于清炒法對(duì)黨參物性及有效成分含量變化的研究△

陳天朝，王嬌，李瑞穎，賈晴晴，程思卿，馬彥江

1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450008；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450000；3.許昌市中醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 許昌 461000

清·徐靈胎的《醫(yī)學(xué)源流論》·方藥·制藥論記載：“或制其形，或制其味，或制其性，或制其質(zhì)……”。說(shuō)明古人已認(rèn)識(shí)到炮制能改變中藥的形、色、氣、味，從而改變中藥的性能。中藥炮制包括水制、火制、水火共制等多種方法，尤其是火制(即清炒法)包括炒黃、炒焦、炒炭，是對(duì)飲片的直接加熱處理，且工藝最簡(jiǎn)單、最基本[1-2]。多糖類藥材黨參為桔?？浦参稂h參的干燥根，具有補(bǔ)中益氣、生津養(yǎng)血的功效[3]。其作為常用藥材，在我國(guó)具有悠久的“藥食兩用”歷史[4]。黨參的炮制方法較多，有米炒，土炒，炒焦，炒炭，蒸制等。臨床上使用炮制品也較多，如黨參片，焦黨參，炒黨參，米炒黨參，黨參炭等[5-6]?；谏鲜觯鶕?jù)前期課題組研究基礎(chǔ)，研究生藥飲片-炒黃飲片-炒焦飲片-炒炭飲片的動(dòng)態(tài)過(guò)程，集成中藥宏觀屬性如中藥飲片物性，分子屬性大分子、小分子的量變?yōu)橹笜?biāo)；通過(guò)研究控制炮制工藝技術(shù)參數(shù)，調(diào)整中藥中成分的含量及其比例，確定其適宜的工藝技術(shù)參數(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

101AS-1型不銹鋼數(shù)顯電熱鼓風(fēng)箱(功率1.8 kw蘇州江東精密儀器有限公司)、BSA224S-CW電子天平(德國(guó)賽多利斯)、KSY可控硅溫控制器(沈陽(yáng)節(jié)能電爐廠)、A-13箱式電阻爐(沈陽(yáng)節(jié)能電爐廠)、CMAG HP7德國(guó)IKA加熱板(上海子期實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)、T11型智能滴定系統(tǒng)(上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司)、MH-500型可調(diào)式電熱套(功率0.2 kw北京科偉永興儀器有限公司)、FW-500高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)、2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》藥典篩(浙江上虞市道墟五四儀器廠)、研缽(江西景德鎮(zhèn))、UliMate 3000高效液相色譜儀(賽默飛公司)。

黨參(批號(hào)：1804092)購(gòu)自安徽普仁中藥飲片有限公司，經(jīng)陳天朝主任藥師鑒定，符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部項(xiàng)下的各飲片來(lái)源規(guī)定；分析純，黨參炔苷(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：203N8B47231，純度≥98%)。

2 方法

2.1 飲片制備

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇炒黃、炒焦、炒炭三種炮制方法，根據(jù)飲片炮制的形、色、氣、味、質(zhì)確定炮制實(shí)驗(yàn)溫度和時(shí)間，炮制工藝如下表1。

表1 不同黨參炮制品對(duì)應(yīng)炮制工藝

2.2 物料參數(shù)的測(cè)定

2.2.1 相對(duì)密度測(cè)定 用100 mL量筒，量取50 mL輕質(zhì)液狀石蠟，靜置3 min，待凹液面穩(wěn)定，用電子天平稱取約5 g飲片物料，投入盛有已知體積的輕質(zhì)液狀石蠟的量筒中，靜置3 min，讀取體積，計(jì)算飲片物料相對(duì)密度。每種飲片平行測(cè)定三次，取平均值作為飲片的相對(duì)密度值[7]，如下表2。

(1)

通過(guò)SPSS相關(guān)性分析，相對(duì)密度與炮制工藝參數(shù)P(X1、X2)=0.101，可得出相對(duì)密度與炮制工藝之間無(wú)顯著性差異。

2.2.2 氧化值測(cè)定 準(zhǔn)確稱取約5 g中藥飲片和200 mL蒸餾水于500 mL圓底燒瓶，混合均勻后接入蒸餾裝置，精確收集前50 mL餾分。用移液管準(zhǔn)確移取10 mL餾分于滴定瓶?jī)?nèi)，加入5 mL H2SO4水溶液和10 mL 0.002 mol·L-1KMnO4溶液，振蕩均勻后室溫下反應(yīng)30 min。加入5 mL 10% KI水溶液，滴加Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液，使溶液由黃棕色或深黃色變成淺黃色時(shí)，加淀粉溶液為指示劑1 mL，用0.02 mol·L-1Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至無(wú)色，記錄消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為A mL[8-9]。另以中藥飲片等質(zhì)量水代替樣品重復(fù)操作進(jìn)行空白試驗(yàn)，記錄消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為B mL，如下表3根據(jù)公式(2)計(jì)算氧化值Ox。

表2 不同黨參炮制品相對(duì)密度測(cè)定結(jié)果

注：*表示P<0.05，差異顯著；**P<0.01，差異高度顯著；X1炮制溫度；X2炮制時(shí)間。

(2)

式中：C為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol·L-1)；200為樣品體積(mL)；0.002為高錳酸鉀溶液的濃度(mol·L-1)；V為樣品蒸餾餾分的取樣量(mL)；M1為稱取樣品的質(zhì)量。

表3 不同黨參炮制品氧化值測(cè)定結(jié)果

通過(guò)SPSS相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)氧化值與炮制溫度相關(guān)性P(X1)=0.047，可知氧化值與炮制工藝之間有顯著相關(guān)性。

2.2.3 吸水率測(cè)定 稱取約5 g中藥飲片，精密稱定置盛有100 mL純化水的磨口錐形瓶中浸泡，分別在累積時(shí)間達(dá)到0、10、20、40、60、120、240、480、720、1440 min后用尼龍網(wǎng)過(guò)濾，測(cè)定原100 mL浸泡用水剩余體積。以浸泡用水體積幾乎不再減少為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，對(duì)飲片在此時(shí)間下測(cè)定，每種飲片平行測(cè)定3次，取平均值作為飲片吸水率，如下表4。

(3)

表4 不同黨參炮制品吸水率測(cè)定結(jié)果

通過(guò)上述數(shù)據(jù)可知，運(yùn)用SPSS軟件分析，(P<0.05)吸水率與炮制工藝(X1、X2)有顯著性，但在(P<0.01)時(shí)無(wú)顯著性，可知吸水率與炮制工藝之間顯著性不明顯。

2.2.4 pH值測(cè)定 準(zhǔn)確稱取約5 g中藥飲片，加水100 mL在室溫條件下，2.2.3項(xiàng)下測(cè)定時(shí)間浸泡。取濾液，測(cè)定pH值，每種飲片平行測(cè)定三份，取平均值，作為該飲片pH值，如下表5。

表5 不同黨參炮制品PH測(cè)定結(jié)果

通過(guò)SPSS分析，可知(P<0.01)時(shí)，炮制工藝與pH之間有顯著性。

2.3 物料主成分含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黨參炔苷對(duì)照品0.005 3 g，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成0.530 0 mg·mL-1的黨參炔苷對(duì)照品溶液。

2.3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取適量黨參炔苷對(duì)照品用甲醇配制溶液，以甲醇為空白，在190～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)波長(zhǎng)掃描?？芍h參炔苷在268 nm處有最大吸收，故以此為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq(5 μm，4.6 mm×250 mm)柱，流動(dòng)相為乙腈-水(體積比25∶75)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)268 nm，進(jìn)樣量5 μL。理論塔板數(shù)以黨參炔苷計(jì)不低于5000。黨參及各炮制品色譜圖如下圖1～5，色譜圖分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同黨參炮制品色譜峰分析結(jié)果

注：“—”表示未測(cè)出該成分。

圖1 黨參炔苷對(duì)照品液相色譜圖

圖2 黨參液相色譜圖

圖3 黨參炒黃液相色譜圖

圖4 黨參炒焦液相色譜圖

圖5 黨參炒炭液相色譜圖

由以上結(jié)果分析可知，可以通過(guò)4號(hào)峰有無(wú)來(lái)區(qū)分炒黃和生品，黨參炒焦后出現(xiàn)了黨參炔苷和3號(hào)峰消失，1、2號(hào)峰增大的情況，產(chǎn)生了新的4號(hào)峰。黨參炒炭后，伴隨著1、2、4號(hào)峰減小，產(chǎn)生5、6、7、8四個(gè)新的特征峰。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取黨參炔苷對(duì)照品溶液0.08、0.18、0.375、0.75、1.5、2.5 mL置10 mL溶量瓶中，加甲醇定容，濃度分別為4.24、9.54、4.24、19.875、39.75、79.5、132.5 μg·mL-1對(duì)照品溶液；在波長(zhǎng)268 nm下方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣濃度X(μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，如下表7，圖6。

表7 黨參炔苷線性關(guān)系

圖6 黨參炔苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

通過(guò)分析得出黨參炔苷峰面積Y與濃度X(μg·mL-1)線性關(guān)系為：Y=0.039 4X-0.043 2求得r=0.999 7說(shuō)明黨參炔苷在濃度4.24～132.5 μg·mL-1之間與其對(duì)應(yīng)的峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 分別取濃度為4.24、19.875、132.5 μg·mL-1對(duì)照品溶液，波長(zhǎng)268 nm下連續(xù)進(jìn)樣5次，每次5 μL，計(jì)算RSD值，如下表8。

表8 黨參炔苷測(cè)定精密度考察結(jié)果

由上表測(cè)定結(jié)果可知，在高、中、低三個(gè)劑量連續(xù)進(jìn)樣條件下，RSD值均小于3%，表明該儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取黨參生品供試品溶液，波長(zhǎng)268 nm下分別于0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣測(cè)定，得黨參炔苷峰面積，計(jì)算其RSD值，如下表9。

由穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果可知，RSD值為0.79%，表明通過(guò)此法處理的供試品，在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表9 黨參樣品中黨參炔苷穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱定黨參生品細(xì)粉5份，加入甲醇25 mL，超聲處理30 min，3000 r·min-1離心20 min，過(guò)濾后上清液用甲醇定容于25 mL備用，制備溶液5份，268 nm波長(zhǎng)下測(cè)定黨參炔苷峰面積，如下表10。

表10 黨參樣品中黨參炔苷重復(fù)性性測(cè)定結(jié)果

由重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果可知，RSD值為1.32%，表明通過(guò)此法處理的黨參樣品來(lái)測(cè)定黨參炔苷，其重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收實(shí)驗(yàn) 稱取黨參生品細(xì)粉9份，同重復(fù)性實(shí)驗(yàn)操作制備溶液9份，在波長(zhǎng)268 nm下測(cè)定黨參炔苷峰面積，其RSD值如下表11。

由上表可知黨參炔苷加樣回收方法良好。

表11 黨參樣品中黨參炔苷加樣回收測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 對(duì)物性的影響

中藥清炒炮制工藝通過(guò)對(duì)物性參數(shù)變化的影響而表現(xiàn)為動(dòng)態(tài)傳遞過(guò)程，主成分含量經(jīng)清炒炮制后存在主成分之間的相互轉(zhuǎn)化，物性與炮制工藝之間存在某種傳遞性。

炒制火候?qū)h參藥材的外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量有顯著影響。隨著火候的加深，黨參相對(duì)密度逐漸下降，炮制改變了黨參內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使得飲片內(nèi)部形成空腔。黨參pH(炒炭除外)值呈下降趨勢(shì)，證明隨著炮制加深，藥材中離子解離度變大，電離出H+增多。通過(guò)測(cè)定藥材的pH值，可對(duì)中藥方劑學(xué)和藥物制劑學(xué)的研究提供某些參考[10]。黨參炮制后氧化值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，炒焦后氧化值上升最明顯，反映炮制后改變其性質(zhì)[11]。表明隨著炒制程度的加大，改變了揮發(fā)油的穩(wěn)定性，散失程度不斷加大[12]。

3.2 對(duì)小分子影響

多糖是由10個(gè)以上的單糖分子通過(guò)糖苷鍵聚合而成的，是分子量較大的多聚物[13]。經(jīng)炒制后黨參炔苷含量顯著下降，出現(xiàn)新峰，說(shuō)明還水溶性糖隨炮制程度加深而降低，黨參物料基礎(chǔ)為葡萄糖分子，受熱之后動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化，分子重新排列組合后可以相互轉(zhuǎn)化。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)米炒對(duì)黨參多糖含量影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明黨參炮制過(guò)程中多糖含量增加主要由炒制引起，輔料米無(wú)實(shí)質(zhì)作用[14]。

炮制是中醫(yī)藥的特色，經(jīng)炮制產(chǎn)生的多種飲片規(guī)格在臨床的功用側(cè)重不同，其機(jī)理尚不完全清楚。清炒炮制不僅是通過(guò)指標(biāo)性成分的變化與否來(lái)說(shuō)明炮制是否合格達(dá)標(biāo)，同時(shí)物性指標(biāo)也能判斷炮制關(guān)鍵和指標(biāo)性成分之間存在一定的作用關(guān)系，同樣影響著炮制飲片臨床療效的發(fā)揮[15-16]。