運(yùn)用信息熵理論優(yōu)化真方白丸膠囊提取工藝△

皮鳳娟，張慶蓮，黃娟*，邵單炫，廖光輝

1.瀘州市中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2.內(nèi)江良輝藥業(yè)有限公司，四川 內(nèi)江 641000

熵[1]是物理學(xué)中的一個(gè)重要概念，表示了任何一種能(能量)在空間分布的均勻程度。1865年，克勞修斯在研究如何提高蒸汽機(jī)效率的基礎(chǔ)上，提出了熵問題。一般而言，當(dāng)一種信息出現(xiàn)概率更高的時(shí)候，表明它被傳播得更廣泛，或者說，被引用的程度更高。我們可以認(rèn)為，從信息傳播的角度來看，信息熵可以表示信息的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)將信息熵理論運(yùn)用于多指標(biāo)評價(jià)的權(quán)重系數(shù)確定，用于客觀評價(jià)正交試驗(yàn)所優(yōu)選的工藝。

“腦卒中”(cerebral stroke)又稱“中風(fēng)”“腦血管意外”(cerebralvascular accident，CVA)，是一種急性腦血管疾病，是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一組疾病，包括缺血性和出血性卒中。缺血性卒中的發(fā)病率高于出血性卒中，占腦卒中總數(shù)的60%～70%[2]。真方白丸子為元代《瑞竹堂方》所載，主要藥物有川烏頭、白附子、半夏、天南星、天麻、全蝎等。方中半夏、天南星、白附子祛風(fēng)化痰；天麻、全蝎息風(fēng)通絡(luò)；川烏以其大辛大熱助其溫通經(jīng)絡(luò)，而枳殼、木香則是以其行氣之力助其疏通經(jīng)絡(luò)，主治中風(fēng)病之半身不遂，于明代中葉失傳[3]。目前，該方被發(fā)掘出來后即受到學(xué)術(shù)界的普遍重視，已成為治療中風(fēng)急性期中經(jīng)絡(luò)的一個(gè)主要方劑。但因其劑型為傳統(tǒng)的丸劑，服用不便，且處方中含有蟲類藥材，具有不良?xì)馕丁，F(xiàn)根據(jù)處方中藥物的特點(diǎn)，考慮將其改進(jìn)成膠囊劑，掩蓋藥物不良嗅味，提高生物利用度。筆者根據(jù)方中藥味主要成分的性質(zhì)，確定對膽南星、枳殼、制川烏、制白附子等藥材進(jìn)行水提[4]。由于《中華人民共和國藥典》2015年版一部未對制白附子、法半夏、膽南星含量測定進(jìn)行相關(guān)規(guī)定，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，膽南星中總膽酸具有抗炎、鎮(zhèn)咳作用[5]，枳殼水提液中3種含量最高的成分從高到低依為柚皮苷、新橙皮苷及異柚皮苷[6]，故以總膽酸、柚皮苷、新橙皮苷及干膏得率為指標(biāo)，運(yùn)用信息熵確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)。

1 儀器與材料

FA2004型電子天平(上海安亭電子儀器廠)；ZDHW調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；紫外分光光度計(jì)；恒溫水浴鍋。

鵝去氧膽酸對照品(批號110806-201507)、柚皮苷對照品(批號110722-201312)、新橙皮苷對照品(批號111857-201703)(中國食品藥品檢定研究院)；所用試劑均為分析純；水為純化水。

膽南星(批號：170401)由內(nèi)江良輝藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)瀘州市中醫(yī)醫(yī)院副主任中藥師張世波鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 柚皮苷與新橙皮苷含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 安捷倫色譜柱C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸(20∶80)為流動(dòng)相；流速為1 mL·min-1；檢測波長為283 nm；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫30 ℃[7-8]。

2.1.2 溶液的制備 供試品溶液制備：按處方量比例稱取制川烏9 g，制白附子9 g，法半夏9 g，枳殼9 g，膽南星9 g，木香9 g，共計(jì)54 g藥材，加10倍量的水，浸泡半小時(shí)，煎煮3次，每次1 h，過濾，取濾液5 mL，精密加入25 mL甲醇，稱定，超聲處理30 min后再次稱定，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，過濾，即得。

對照品溶液制備：精密稱取柚皮苷、新橙皮苷對照品各5 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別吸取上述對照品溶液各2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成混合對照品溶液。

陰性對照品溶液：按處方量比例稱取除枳殼外的水提藥材，按照供試品溶液制備的方法，制備缺枳殼的陰性對照溶液。

2.1.3 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、缺枳殼陰性對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件檢測。結(jié)果對照品溶液和供試品溶液在相同的保留時(shí)間均有出峰，陰性對照無干擾，見圖1。

注：A.缺枳殼陰性液；B.柚皮苷和新橙皮苷對照品液；C.供試品溶液；1.柚皮苷；2.新橙皮苷。圖1 真方白丸膠囊水提液HPLC圖

2.1.4 線性范圍考察 精密稱取柚皮苷對照品和新橙皮甘對照品適量，用甲醇稀釋制成柚皮苷對照品質(zhì)量濃度為0.020 16 ～0.205 8 mg·mL-1，新橙皮苷對照品質(zhì)量濃度為0.020 52 ～0.171 0 mg·mL-1的混合對照品溶液，在上述色譜條件下，分別取混合對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，以進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=1582.1X+35.083(r=0.999 9)和Y=1 834.3X-17.546(r=0.999 9)。結(jié)果表明：柚皮苷在0.2～2 μg，新橙皮苷在0.2～1.7 μg進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 吸取2.1.2項(xiàng)下樣品溶液適量，重復(fù)測定6次，結(jié)果柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD值分別為0.75%、0.79%，表明該方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液，在0、2、4、6、8 h分別進(jìn)樣10 μL，記錄2個(gè)成分的峰面積，計(jì)算RSD分別為0.41%、0.51%，結(jié)果表明柚皮苷和新橙皮苷均在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照上述色譜條件平行操作測定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果2個(gè)成分的RSD值均小于3.0%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 耐用性試驗(yàn) 取同一批樣品，照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，改變色譜柱溫度±5 ℃、流動(dòng)相比例±5%，流速±2%，進(jìn)行耐用性試驗(yàn)。結(jié)果RSD<3.0%，說明本方法穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知柚皮苷和新橙皮苷含量的樣品2.5 mL，共6份，分別置于具塞錐形瓶中，每份均精密加入質(zhì)量濃度為0.170 6 mg·mL-1的柚皮苷對照品儲(chǔ)備液5 mL，質(zhì)量濃度為0.172 0 mg·mL-1新橙皮苷對照品儲(chǔ)備液5 mL。照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照上述色譜條件平行操作測定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果RSD<3.0%，說明加樣回收率好。結(jié)果見表1～2。

2.1.10 含量測定 取3批真方白丸膠囊提取液，依法制備供試品液并測定柚皮苷和新橙皮苷的含量。3批真方白丸膠囊提取液柚皮苷平均質(zhì)量濃度為0.264 mg·mL-1，新橙皮苷平均含量為0.249 mg·mL-1。

2.2 UV法測定總膽酸含量

2.2.1 溶液的制備 對照品溶液：取鵝去氧膽酸對照品5.02 mg，置10 mL量瓶中，用冰乙酸溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲(chǔ)備液。分別精密移取對照品儲(chǔ)備液適量至10 mL量瓶中，加冰乙酸稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為50.2、2.51 μg·mL-1的對照品溶液[9-10]。

供試品溶液：取提取液2 mL，置錐形瓶中，加入10 mL乙酸乙酯，水浴加熱回流2.5 h，加入0.6 g活性炭，再加熱回流0.5 h，過濾，蒸干，殘?jiān)?0%冰乙酸溶液溶解并稀釋至10 mL，取1 mL稀釋液加入14 mL 50%硫酸溶液，搖勻后于75 ℃水浴10 min，立即冰浴2 min，即得。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0 mL的鵝去氧膽酸對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.050 2 mg·mL-1)置試管中，以60%冰乙酸溶液作為空白，于377 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.022 3X-7×10-6，r=0.999 9。結(jié)果表明，鵝去氧膽酸在0～0.016 73 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密移取提取液2 mL，照供試品溶液項(xiàng)下方法制備，以60%冰乙酸為空白對照溶液，于377 nm處測定，重復(fù)操作6次，RSD為0.45%，表明儀器精密度好。

表1 柚皮苷加樣回收率試驗(yàn)

表2 新橙皮苷加樣回收率試驗(yàn)

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密移取提取液2 mL，共6份，照供試品溶液項(xiàng)下方法處理并測定吸光度。計(jì)算得到總膽酸平均質(zhì)量濃度為28.509 mg·mL-1，RSD為2.59%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.3項(xiàng)下其中一份樣品，分別于0、0.5、1、1.5、3、6 h測定其吸光度，RSD為2.35%，表明樣品溶液在6 h內(nèi)測定基本穩(wěn)定。

2.2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密移取提取液1 mL，6份，分別加入鵝去氧膽酸對照品溶液(質(zhì)量濃度為2.51 μg·mL-1)1 mL，照供試品溶液制備方法操作，于377 nm處測定其吸收度，結(jié)果平均值為99.57%，RSD為2.89%。

2.2.7 樣品含量測定 取3批真方白丸膠囊提取液，照2.2.1項(xiàng)下供試品制備方法制備并測定總膽酸含量。3批真方白丸膠囊提取液總膽酸平均質(zhì)量濃度為0.174 mg·mL-1。

2.3 水提工藝的考察

2.3.1 因素與水平 以加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)為考察因素，每種因素取3個(gè)水平，以柚皮苷、新橙皮苷、總膽酸含量和干浸膏得率為考察指標(biāo)，選用正交設(shè)計(jì)表L9(34)進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表3[11-13]。

2.3.2 數(shù)據(jù)處理 建立原始評價(jià)指標(biāo)矩陣(X)，再將其轉(zhuǎn)換成“概率”矩陣(P)。具體如下[14]。

計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)的信息熵(Hi)，得到評價(jià)指標(biāo)[0.991 29 0.991 32 0.957 41 0.984 59]，再計(jì)算第i項(xiàng)指標(biāo)的系數(shù)Wi[0.115 53 0.115 07 0.564 95 0.204 45]。綜合評分Mm=P1 m×W1+P2 m×W2+P3 m×W3+P4 m×W4，即柚皮苷提取率、新橙皮苷提取率、總膽酸含量、干浸膏收率的權(quán)重系數(shù)分別為0.115 53、0.115 07、0.564 95、0.204 45。

將概率矩陣的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)處理后，得到

綜合評價(jià)指標(biāo)M，再進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4～5。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表

表5 方差分析結(jié)果

注：F0.01(2，2)=99，F(xiàn)0.05(2，2)=19，*表示P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

從表2可知，各因素對有效成分得率的影響程度依次為B>C>A，即煎煮次數(shù)>煎煮時(shí)間>加水量，故正交所得最佳提取工藝為A1B3C2。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加水量為6倍，提取3次時(shí)每次煎煮0.5 h所得結(jié)果與煎煮1 h和1.5 h接近；當(dāng)提取次數(shù)為3次，每次煎煮30 min時(shí)加水量為10倍所得結(jié)果明顯高于6倍和8倍。根據(jù)方差分析結(jié)果顯示，A、C因素影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B因素影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合直觀分析和方差分析，同時(shí)考慮節(jié)約能源，確定最佳提取工藝為A3B3C1，即加10倍量水，煎煮3次，每次0.5 h。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行進(jìn)行3次。柚皮苷平均提取率為88.74%，RSD為0.40%。新橙皮苷平均提取率為87.97%，RSD為0.81%。鵝去氧膽酸率平均含量為7.55 mg·g-1，RSD為1.50%。干浸膏平均得率為32.73%，RSD為0.41%。表明工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

水提工藝中，筆者首先考察了藥材的吸水率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥材在前30 min內(nèi)吸水最快，達(dá)40 mL，30 min以后吸水速度開始下降，浸泡6 h后不再吸水，故將浸泡時(shí)間確定為0.5 h[15]。

在UV法測定提取液總膽酸含量時(shí)，筆者考察了乙酸乙酯的加入體積對總膽酸含量測定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測定結(jié)果與乙酸乙酯加入體積無關(guān)，但與提取時(shí)所采用的冷凝管有關(guān)。提取時(shí)采用蛇形冷凝管比球形冷凝管的總膽酸含量高，可能是因?yàn)橐宜嵋阴ヒ讚]發(fā)，蛇形冷凝管接觸面大，更易于溶液的冷凝回流。

選用正交試驗(yàn)優(yōu)化水提工藝參數(shù)過程中[16-17]，采用多指標(biāo)綜合評分法，以柚皮苷、新橙皮苷轉(zhuǎn)移率、總膽酸含量和干浸膏為考察指標(biāo)，根據(jù)信息熵理論[18-19]對其賦予不同的權(quán)重，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行綜合評價(jià)。這種方法既在客觀上保留了考察指標(biāo)的完整性，又在理論上對各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行客觀的權(quán)重分配，使分析結(jié)果更加客觀和科學(xué)，由此優(yōu)選的工藝參數(shù)更合理，可為真方白丸膠囊的大生產(chǎn)提供參考。