Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選心痛寧膠囊的水提工藝△

劉怡，如扎·哈布都拉，李露，王萍，2，孟瑤，依孜提·帕力哈提，張麗娟，聶繼紅，2*

1.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000

心痛寧膠囊是國醫(yī)大師沈?qū)毞淌谝浴疤叼鐾巍睘橹笇?dǎo)，臨床應(yīng)用三十余年的經(jīng)驗(yàn)方。

它由丹參和紅花等藥材組成，可顯著改善冠心病患者的臨床癥狀?，F(xiàn)代藥理研究表明，方中丹參、紅花等中藥材具有抗血小板聚集、抗血栓形成等多重藥理作用[1-5]。最初的處方是湯劑，后被開發(fā)成膠囊以便于攜帶和儲存。

Box-Behnken響應(yīng)面法是優(yōu)化工藝條件的有效方法，廣泛應(yīng)用于多因素試驗(yàn)優(yōu)化[6-7]。經(jīng)過優(yōu)選得到的心痛寧膠囊的水提工藝合理，可操作性強(qiáng)，為將來的生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Waters-2695)；紫外-可見分光光度計(jì)(Cintra20)；SI-234電子天平[丹佛儀器(北京)有限公司]；Direct-QTM5超純水儀(Millipore)；xXMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

1.2 試藥

丹酚酸B對照品、D-無水葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院)；磷酸為分析純；甲醇、乙腈為色譜純。

丹參、紅花等藥材飲片均購買于亳州市中正藥材飲片有限公司，經(jīng)檢驗(yàn)符合2015版《中華人民共和國藥典》收載各飲片項(xiàng)下的質(zhì)量要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹酚酸B的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱Shield RP18(250 mm×4.6 mm，5m)；流動相：乙腈-0.1%磷酸(29∶71)；體積流量：1.0 mL·min-1；檢測波長：286 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃[8-10]。

2.1.2 對照品溶液的制備 稱取精準(zhǔn)適量對照品，通過使用色譜甲醇制備質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的丹酚酸B儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 根據(jù)提出的試驗(yàn)方案，提取稱重的水提取物并置于1000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量水并加熱回流1 h，冷卻后，將提取液經(jīng)紗布過濾，離心1 h后取上清液10 mL蒸干，在完全溶解5 mL甲醇后，溶解液用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

注：A.丹酚酸B對照品；B.心痛寧膠囊水提液供試品；C.缺丹參的陽性對照。圖1 心痛寧膠囊中丹酚酸B的含量測定結(jié)果圖

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 稱取不包括丹參在內(nèi)其余擬水提的飲片，提取制備陰性樣品溶液。

2.1.5 線性范圍研究 準(zhǔn)確測定在2.1.2項(xiàng)下丹酚酸B的儲備液，用色譜甲醇分別稀釋至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1，分取這5個不同質(zhì)量濃度梯度的溶液，注入液相色譜儀，得回歸方程：Y=12 951 793X-32 554.7(r=0.999 9)，其中X為濃度，Y為對應(yīng)的峰面積，體現(xiàn)在0.1～0.5 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取一份制備好的參比液，連續(xù)進(jìn)樣6次，試驗(yàn)最終得到的RSD值為0.54%，表明方法的精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按照規(guī)定的方法并行準(zhǔn)備6份試驗(yàn)溶液并分別進(jìn)樣，得到的峰面積的RSD值為1.44%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取相同的試驗(yàn)溶液，在制備后的第0、6、8、12、24、48 h進(jìn)樣，丹酚酸B峰面積的RSD值為1.99%，說明該方法的穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 取6份待測樣品，從中吸取一定量，按同比量加入丹酚酸B參比物后記錄其峰面積，結(jié)果平均加樣回收率為103.48%，RSD值為1.11%，表明該分析方法準(zhǔn)確。

2.2 總多糖的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 使用超純水制備質(zhì)量濃度為0.05 mg·mL-1的D-無水葡萄糖參比物儲備溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 根據(jù)試驗(yàn)方案提取飲片并保存以備后用。

2.2.3 苯酚溶液的制備 用溫水制取5%的苯酚溶液，低溫貯存避光。

2.2.4 最大吸收波長的確定 分別精密吸收D-無水葡萄糖對照品溶液0.1 mL，將0.1 mL樣品溶液置于1000 mL的量瓶中，用等體積的超純水稀釋，充分混勻，加入0.1 mL稀釋劑，置于10 mL試管中，將5%苯酚溶液1 mL和濃硫酸溶液5 mL加入1 mL的超純水中混合10 min，然后，將混合物在沸水中加熱20 min，取出空白液體，并將混合物快速冷卻至室溫，并以相同的方式制備空白液體用于測量，掃描結(jié)果見圖2，波長范圍為350～700 nm[11-13]。結(jié)果表明，樣品溶液和對照物在485.6 nm處有最大吸收。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別準(zhǔn)確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL儲備液。在上述顯色方法下分別測定其吸光度(A)。將吸光度作為縱坐標(biāo)，將D-無水葡萄糖濃度作為橫坐標(biāo)，得回歸方程：Y=14.58X+0.071 8(r=0.999 9)，說明D-無水葡萄糖在0.01～0.05 mg線性關(guān)系良好。

圖2 總多糖紫外吸收光譜

2.2.6 精密度試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸量適當(dāng)D-無水葡萄糖，按規(guī)定方法顯色后連續(xù)測量6次，RSD值為0.26%，說明該方法的精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù)測試方案平行制備6個樣品，RSD值為0.42%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸收適量的試樣溶液，分別于制備后的第0、30、60、90、120、150、180 min按上述方法顯色，測定吸光度以獲得RSD值為1.15%，表明樣品溶液在3 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知D-無水葡萄糖濃度的試樣溶液，制備6個樣品和對照品含量為1∶1的混合液，并通過上述方法測量吸光度，結(jié)果平均加樣回收率為98.09%，RSD值為0.28%。

2.3 浸膏得率的測定

用移液管吸量50 mL供試品溶液上清液，放入已重量恒定的坩堝中，先在水浴鍋中蒸干后轉(zhuǎn)移至烘箱內(nèi)，設(shè)置105 ℃后，干燥至恒定質(zhì)量，取出，冷卻，稱重干燥器并計(jì)算提取物產(chǎn)量[14]。

(1)

2.4 提取工藝的研究

以加水倍量(X1)、提取時間(X2)和浸泡時間(X3)作為自變量來研究提取過程。以丹酚酸B、總多糖的含量及浸膏得率的綜合評分為因變量，根據(jù)評價指標(biāo)對水提工藝的影響，擬定綜合評分=丹酚酸B×0.4+總黃酮×0.3+浸膏得率×0.3。

2.5 單因素試驗(yàn)

通過浸泡時間、加水量、提取時間，測試提取次數(shù)，并且基于分析結(jié)果來確定Box-Behnken響應(yīng)面測試的因素范圍[15-17]。

2.5.1 加水倍量初步考察 加水倍量的初始評價將提取次數(shù)固定為1次，提取時間固定為60 min，浸泡時間固定為30 min。依次考察加水倍量6、8、10、12倍時的綜合評分，結(jié)果在加水10倍量時，綜合評分最高。因此，作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)范圍的加水倍量為8、10、12倍，最佳為10倍。

2.5.2 提取時間初步考察 提取時間初始評價將加水倍量固定為10倍，浸泡時間固定為30 min，提取次數(shù)固定為1次。依次考察提取30、60、90、120 min時的各組分含量，結(jié)果提取60 min時得到最高評分，因此，提取30、60、90 min作為響應(yīng)表面設(shè)計(jì)范圍，并且提取60 min是最佳的。

2.5.3 浸泡時間初步考察 浸泡時間初始評價將加水倍量固定為10倍，提取時間固定為60 min，提取時間固定為1次。浸泡時間依次為60、90、120、150 min，結(jié)果浸泡120 min時，綜合評分達(dá)到最高。因此，作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)范圍的浸泡時間為90、120、150 min，最佳浸泡時間為120 min。

2.5.4 提取次數(shù)的初步考察 初步將加水倍量固定為10倍，提取時間固定為60 min，浸泡時間固定為120 min。經(jīng)過提取1、2和3次后，最終綜合評分依次增加，因此提取次數(shù)確定為3次。

2.6 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

基于單因素試驗(yàn)，確定了Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)中各因素的適用范圍[18]。Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)采用加水倍量(X1)、提取時間(X2)和浸泡時間(X3)作為指標(biāo)，按表1進(jìn)行試驗(yàn)。提取次數(shù)固定為1次。結(jié)果見表2。

2.6.1 結(jié)果分析 利用方差分析對各因素進(jìn)行多元二次回歸，得到的回歸方程Y=93.47+7.19X1+2.41X2+1.80X3-6.49X1X2-0.050X1X3-2.78X2X3-16.73X12-18.51X22-10.10X32，由表3可知，X1、X2、X1X2、X12、X22、X32的影響顯著，影響程度為X1>X2>X3。失擬項(xiàng)P>0.05，回歸方程可以更好地分析和預(yù)測本研究的水提過程。

2.6.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 響應(yīng)面分析和優(yōu)化使用Design-Expert軟件[19-20]，獲得了加水倍量、提取時間、浸泡時間的綜合評分的三維響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖3～4，能直接反映3個自變量與綜合得分之間的相互作用。利用Design-Expert軟件預(yù)測了最佳提取工藝：加水10.87倍，浸泡128.30 min，提取58.72 min。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)要求，確定了最佳的水提工藝流程：加水11倍，提取60 min，浸泡130 min，提取3次。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素及水平

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

2.6.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)最佳提取工藝，進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，綜合得分為99.56、98.34、99.84，平均綜合得分為99.25(RSD為0.80%)，與預(yù)測值(94.33)一致。結(jié)果表明，該方法是合適的，優(yōu)化后的提取工藝是合理可行的。

圖3 各因素對綜合評分的三維響應(yīng)面圖

圖4 提取工藝對各因素之間的等高線圖

3 討論

丹參中富含的丹參酮和丹酚酸B有顯著的抗血小板凝集作用，相比于含量低、穩(wěn)定性差的丹參酮類成分，水溶性的酚酸類成分具有藥理活性相對較強(qiáng)、含量高等特點(diǎn)，故本研究選用了易溶于水的丹酚酸B作為指標(biāo)性成分。

參考2015年版《中華人民共和國藥典》，采用乙腈-0.1%磷酸(22∶78)作為流動相測定丹酚酸B，但分離度及峰形效果不符合要求，因而調(diào)整了乙腈-0.1%磷酸的比例，最后將流動相確定為乙腈-0.1%磷酸(29∶71)。

Box-Behnken響應(yīng)面法可以在因素和響應(yīng)值之間建立模型，它不僅能擬合相關(guān)數(shù)據(jù)，篩選出最佳工藝，而且能夠準(zhǔn)確預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果，精度高。另外，Box-Behnken響應(yīng)面法克服了正交試驗(yàn)無法得到整體因素中的最佳組合及響應(yīng)值的缺點(diǎn)，在未來中藥領(lǐng)域的研究中將會得到廣泛應(yīng)用。本研究以丹酚酸B、總多糖含量和浸膏得率的綜合評分為指標(biāo)，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面法對心痛寧膠囊的水提工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了綜合評分與各自變量之間的數(shù)學(xué)模型，為心痛寧膠囊的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。