兩種甘草種子偽品的鑒別△

尚興樸，鄧庭偉，曾燕，鄭司浩，王繼永，*，史玉寶，楊連兵，盧禎林，王凱

1.中國(guó)中藥有限公司，北京 100195；2.國(guó)藥種業(yè)有限公司，北京 102600；3.甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741025

甘草GlycyrrhizauralensisFisch.是豆科Leguminosae甘草屬Glycyrrhiza多年生植物[1]，在我國(guó)集中分布于三北地區(qū)[2]，是構(gòu)成我國(guó)北方荒漠植被的重要植物，具備生態(tài)和經(jīng)濟(jì)的雙重價(jià)值[3]。近年來(lái)隨著生態(tài)環(huán)境的破壞及無(wú)節(jié)制的采挖，甘草資源狀況日益嚴(yán)峻[4]，為滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，人工甘草的種植面積逐年增加，甘草種子價(jià)格也逐年攀升。魏建和等[4]收集了3個(gè)省份的甘草種子，發(fā)現(xiàn)甘草種子質(zhì)量差異較大，綠籽的質(zhì)量顯著高于黑籽。孫群等[6]研究了10份市售甘草種子的質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)市售甘草種子質(zhì)量良莠不齊，凈度、發(fā)芽率、硬實(shí)等差異較大。王立平等[7]分析了4份市售甘草種子的發(fā)芽率，其中灰綠色種子發(fā)芽率最高。于福來(lái)等[8]初步建立了甘草種子的質(zhì)量檢驗(yàn)方法。

為充分了解市售甘草種子的質(zhì)量及市場(chǎng)行情，2018年5月～8月，筆者前往內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、寧夏等地展開(kāi)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)除了種子質(zhì)量差異較大外，更嚴(yán)重的是市場(chǎng)上出現(xiàn)了兩種甘草種子偽品，其種子形態(tài)、皮色等與甘草種子差異不明顯，若混雜于甘草種子中，種植戶(hù)較難辨識(shí)。趙文吉等[9]曾在調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)中經(jīng)營(yíng)中藥材種子種苗的大部分從業(yè)人員缺乏對(duì)種子種苗真?zhèn)舞b別等的專(zhuān)業(yè)知識(shí)。所以，本實(shí)驗(yàn)采用種子質(zhì)量檢驗(yàn)與DNA序列分析相結(jié)合的方法展開(kāi)甘草種子偽品的鑒別研究，以期為甘草種子經(jīng)營(yíng)者及種植戶(hù)提供兩種甘草種子偽品的鑒別技術(shù)方法，達(dá)到推動(dòng)甘草種子市場(chǎng)良性發(fā)展的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年8月，筆者調(diào)研時(shí)發(fā)現(xiàn)市售甘草種子中摻有兩種類(lèi)似甘草種子的種子，其中一種類(lèi)似于生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)中稱(chēng)為“黑籽”的黑色種子[5]，一種種皮顏色為棕色但形狀為“葫蘆狀”的種子，分別取名為“黑豆子”、“葫蘆子”，編號(hào)為HZ、HL，每種市售甘草種子各取樣1 kg作為研究材料，采用杭錦旗甘草種子做對(duì)照樣品，編號(hào)為GC。具體信息見(jiàn)表1。

表1 市售甘草種子樣品信息表

1.2 方法

1.2.1 種子質(zhì)量檢驗(yàn)

1.2.1.1 種子凈度的測(cè)定 按GB/T 3543.3—“農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程”凈度分析執(zhí)行。結(jié)合10目和8目篩子，在不損傷發(fā)芽力的基礎(chǔ)上進(jìn)行檢查，直接挑選純凈種子。[8]每份種子隨機(jī)選取10 g，3次重復(fù)測(cè)定甘草種子偽品、其他雜質(zhì)和凈甘草種子的質(zhì)量。

1.2.1.2 種子千粒質(zhì)量的測(cè)定 采用百粒法測(cè)定“黑豆子”、“葫蘆子”及甘草種子的千粒質(zhì)量[8]，隨機(jī)數(shù)取100粒，重復(fù)5次，分別記錄百粒質(zhì)量。

1.2.1.3 種子形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定 隨機(jī)選取10粒“黑豆子”、“葫蘆子”及甘草種子，用游標(biāo)卡尺測(cè)定種子的長(zhǎng)、寬和種子厚度，重復(fù)5次。[10]

1.2.1.4 種子真實(shí)性鑒定 對(duì)“黑豆子”、“葫蘆子”及甘草種子的形態(tài)、表面特征和種子顏色進(jìn)行鑒定。

1.2.2 DNA序列分析

1.2.2.1 DNA提取 每份樣品種子選取10粒，單粒切碎后，用FRITSCH P6球磨儀(德國(guó)Fritsch公司)進(jìn)行完全粉碎。采用植物組織提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA，-20 ℃保存。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 ITS序列擴(kuò)增及PCR條件參照文獻(xiàn)[10]，正向引物ITS 5F為5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，反向引物 ITS 4R為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2 μL DNA，12.5 μL 2×Taq plus PCR Master Mix，各1 μL(10 μmol·L-1)引物(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)，8.5 μL H2O。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2.3 數(shù)據(jù)處理 用CodonCode Aligner V5.1.5(Codon Code Co.，USA)軟件對(duì)測(cè)序后獲得的ITS序列結(jié)果進(jìn)行校對(duì)和序列拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，采用 MEGA 6.05(Molecular evolutionary genetics analysis)進(jìn)行比對(duì)分析，修剪后的ITS序列提交NCBI(National Center for Biotechnology Information)進(jìn)行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子質(zhì)量檢驗(yàn)分析

2.1.1 種子凈度分析 種子凈度分析結(jié)果見(jiàn)表2，3份市售甘草種子樣品中，甘草種子偽品的平均占比分別為50.59%(“黑豆子”)、46.24%(“葫蘆子”)、0，凈甘草種子的平均占比分別為39.44%、44.87%、98.16%。結(jié)果表明，市售甘草種子1、2中凈甘草種子的占比均不足50%，嚴(yán)重的影響了正常甘草種子的質(zhì)量；而市售甘草種子3的凈度在98%以上，符合甘肅省(≥98%)[12]、安徽省(≥97%)[13]、北京市(≥95%)[14]的甘草種子地方標(biāo)準(zhǔn)。

表2 3份樣品種子凈度測(cè)定

2.1.2 種子千粒質(zhì)量、形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定及真實(shí)性鑒定 種子千粒質(zhì)量、形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果顯示“黑豆子”HZ的千粒質(zhì)量、長(zhǎng)、寬、厚均大“葫蘆子”HL、甘草種子GC，除厚度外也均超出于福來(lái)等[7]對(duì)甘草種子真實(shí)性鑒定的最大值，“葫蘆子”HL與甘草種子GC的千粒質(zhì)量、長(zhǎng)、寬、厚相近，從數(shù)據(jù)上暫時(shí)較難進(jìn)行區(qū)分。

通過(guò)對(duì)“黑豆子”、“葫蘆子”及甘草種子的表面特征和顏色觀(guān)察(見(jiàn)圖1)發(fā)現(xiàn)，HZ呈腎圓形，兩端鈍圓，表面黑色，無(wú)光澤，種臍位于腹部凹陷處；HL呈葫蘆狀，上窄下寬，表面暗棕色，略有光澤，種臍不明顯，種皮較堅(jiān)硬；GC呈腎圓形，兩端鈍圓，表面黃綠色至暗綠色，光滑，略有光澤，種臍位于腹部凹陷處。僅GC形態(tài)符合于福來(lái)等[8]對(duì)甘草種子的真實(shí)性鑒定。

表3 甘草種子及其偽品的千粒質(zhì)量與大小

注：GC.甘草種子；HZ.“黑豆子”；HL.“葫蘆子”圖1 甘草種子形態(tài)對(duì)比圖

2.2 DNA堿基序列分析

通過(guò)對(duì)30份ITS序列的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校對(duì)、拼接、比對(duì)發(fā)現(xiàn)，三者的堿基序列存在明顯差異，堿基相似度極低，修剪后的序列長(zhǎng)度分別為627 bp、636 bp、389 bp。單倍型分析發(fā)現(xiàn)，HZ僅有1種單倍型，HL共有4種單倍型，GC有1種單倍型。分別將三者不同單倍型的堿基序列提交NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。DNA堿基序列結(jié)果表明，HZ、HL均不是甘草種子，HZ的堿基序列BLAST結(jié)果為豆科野決明屬種子，HL 4種單倍型的BLAST結(jié)果為漆樹(shù)科鹽膚木屬或者苦木科鴉膽子屬種子，兩者均為甘草種子偽品，而市售甘草種子3杭錦旗種子為甘草種子。

3 討論與結(jié)論

3.1 市售甘草種子現(xiàn)狀與真假鑒別

通過(guò)市場(chǎng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前市場(chǎng)上流通的甘草種

子主要為烏拉爾甘草種子，種子質(zhì)量不僅存在凈度、發(fā)芽率、硬實(shí)等差異均較大的問(wèn)題，還存在不同產(chǎn)區(qū)甘草種子混雜銷(xiāo)售、產(chǎn)新種子與陳舊種子混雜銷(xiāo)售等現(xiàn)象，更嚴(yán)重的是出現(xiàn)了兩種其他植物種子冒充甘草種子銷(xiāo)售的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)從種子質(zhì)量檢驗(yàn)、DNA堿基序列分析方面著手展開(kāi)研究，種子凈度的高低是決定種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣的關(guān)鍵因素之一，高凈度的種子可有效降低種植戶(hù)的用種量及成本；種子千粒質(zhì)量是衡量種子質(zhì)量的主要指標(biāo)[10]，同時(shí)也是種子質(zhì)量分級(jí)的衡量標(biāo)準(zhǔn)之一；種子形態(tài)觀(guān)察為種子真實(shí)性鑒定提供了一種直觀(guān)、有效的鑒別方式，在具備相關(guān)專(zhuān)業(yè)知識(shí)的基礎(chǔ)上，可迅速及時(shí)的做出真假種子的鑒別；DNA條形碼技術(shù)是中藥材種子種苗鑒定的有效手段[11]，具有快速、準(zhǔn)確、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)未知物種的鑒定[15]，研究結(jié)果表明甘草種子及其偽品間存在較大差異，該方法可成為甘草種子經(jīng)營(yíng)者及種植戶(hù)鑒別市售甘草種子偽品的有效技術(shù)手段。

3.2 DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用

DNA條形碼是指利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的 DNA 片段作為物種標(biāo)記而建立的一種新的生物鑒定方法，由加拿大分類(lèi)學(xué)家 PaulHebert于2003年首次提出[16]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)的運(yùn)用逐漸進(jìn)入到了藥材及種子種苗鑒定的范疇，是經(jīng)典分類(lèi)學(xué)方法的有力補(bǔ)充和革命性突破，其依賴(lài)于植物的遺傳特征，不受植物生長(zhǎng)時(shí)期的影響，所以對(duì)于中藥材種子種苗的鑒定具有特別重要的意義[11，17-20]。本文將DNA條形碼技術(shù)用于3種市售甘草種子及其偽品的鑒別研究，結(jié)果表明，ITS序列可有效區(qū)分“黑豆子”、“葫蘆子”及甘草種子，有效地避免了依賴(lài)于植物形態(tài)和性狀的傳統(tǒng)鑒定方法的局限性。該技術(shù)可成功用于市售甘草種子的鑒別，對(duì)于保障甘草種子的真實(shí)性，保障人工種植甘草的質(zhì)量、甘草經(jīng)營(yíng)戶(hù)或種植戶(hù)的生產(chǎn)效益，甚至甘草產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

表4 樣品BLAST鑒定結(jié)果

3.3 中藥材種業(yè)現(xiàn)狀與展望

種好，苗好，藥材好。中藥材種子種苗是藥材生產(chǎn)的最基本、最重要的生產(chǎn)資料[11]，中藥材種業(yè)作為中藥材產(chǎn)業(yè)的源頭，其質(zhì)量是決定藥材品質(zhì)的關(guān)鍵因素和先決條件。而我國(guó)中藥材種業(yè)尚未形成獨(dú)立的產(chǎn)業(yè)，仍然是藥材生產(chǎn)的附屬，處于一種自產(chǎn)自銷(xiāo)的原始生產(chǎn)狀態(tài)，中藥材種業(yè)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程處于起步階段。在此背景條件下，市售中藥材種子難免存在質(zhì)量參差不齊、摻假售假現(xiàn)象。為此，筆者認(rèn)為應(yīng)盡快出臺(tái)《中藥材種子管理辦法》，規(guī)范中藥材種子生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)行為，培育中藥材種子龍頭企業(yè)，推動(dòng)中藥材產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。同時(shí)，應(yīng)當(dāng)著力開(kāi)展中藥材種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究，形成統(tǒng)一的檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范，為推進(jìn)中藥材種業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支撐。