馬齒莧-肉桂聯(lián)用提取工藝及其對DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎的作用研究△

任浪浪，唐志書，梁艷妮，劉力，宋忠興，黃文靜，王征

陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/陜西省風(fēng)濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 712083

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種非特異性的炎癥性疾病，涉及黏膜和大腸黏膜下層直腸。在特殊情況下，定義為全腸炎，可能會影響整個大腸[1]。臨床表現(xiàn)主要為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，內(nèi)鏡下結(jié)腸呈糜爛、潰瘍等彌漫性炎癥，組織病理學(xué)表現(xiàn)為黏膜或黏膜下彌漫性炎癥反應(yīng)、杯狀細(xì)胞減少、隱窩結(jié)構(gòu)破壞[2-3]。研究報道顯示UC的發(fā)生與體內(nèi)抑炎因子、促炎因子的失衡密切相關(guān)。炎癥細(xì)胞因子異常增多或抑炎細(xì)胞因子異常減少均可促進(jìn)腸黏膜炎癥的變化，而持久的免疫調(diào)節(jié)失衡則促使炎癥趨于慢性化[4]。潰瘍性結(jié)腸炎活動期白細(xì)胞介素-10(IL-10)表達(dá)水平降低[5]，腫瘤壞死因子(TNF-α)表達(dá)水平升高，使體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)失衡，從而誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎[6]。目前我國UC發(fā)病呈上升趨勢。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[7]，馬齒莧多糖對DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型具有很好的治療作用，可明顯改善小鼠結(jié)腸的病理結(jié)構(gòu)，平衡體內(nèi)炎癥因子和抑炎因子的水平。有文獻(xiàn)報道，肉桂水提液對UC有很好的療效[8]。我校國家中醫(yī)藥管理局脾胃病重點(diǎn)學(xué)科學(xué)術(shù)帶頭人劉力教授在30多年的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，馬齒莧-肉桂聯(lián)用對治療UC具有良好效果，但其作用機(jī)理尚未明確，目前也沒有關(guān)于馬齒莧-肉桂聯(lián)用治療UC的文獻(xiàn)報道。故本課題組對馬齒莧-肉桂聯(lián)用的最佳配比及其治療UC的作用進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 儀器

電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計UV-2006(島津有限公司)；FA2004B型電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；IMS-50制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司)；酶標(biāo)儀(Multiskan GO)-1510 (Thermo Fisher)。

1.2 材料

1.3 動物

昆明種SPF級雄性小鼠60只，體質(zhì)量(20±2)g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證許可證號：SCXK(陜)2017-003。

2 方法

2.1 馬齒莧-肉桂聯(lián)用提取工藝研究

前期研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖對UC小鼠具有確切的治療作用，故馬齒莧-肉桂聯(lián)用最佳配比評價采用馬齒莧多糖含量為指標(biāo)，以臨床常用配比馬齒莧-肉桂(12∶5)為參照。

2.1.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用苯酚-硫酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]，得回歸方程為Y= 5.461 6X+ 0.092 3(r= 0.999 3)，線性范圍為0.025～0.15 mg·mL-1。

2.1.2 多糖提取率的計算 根據(jù)不同的提取工藝進(jìn)行提取，將提取液濃縮至黏稠狀冷凍干燥，稱取0.010 g凍干樣品，純凈水定容至100 mL，即得樣品供試液；精確吸取供試液1 mL，用紫外分光光度法在490 nm處測得吸光度A值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線求多糖濃度，計算凍干樣品中多糖的含量。多糖提取率為多糖占馬齒莧配伍肉桂原藥材質(zhì)量的百分比。

2.1.3 馬齒莧-肉桂配比對多糖提取率的影響 在料液比1∶40、提取溫度100 ℃、用水提取4 h的條件下，考察馬齒莧-肉桂不同配比對多糖提取率的影響。

2.1.4 料液比對多糖提取率的影響 在馬齒莧-肉桂配比12∶5、提取溫度100 ℃、用水提取4 h的條件下，考察不同料液比對多糖提取率的影響。

2.1.5 提取溫度對多糖提取率的影響 在料液比1∶40、馬齒莧-肉桂配比12∶5、用水提取時間4 h的條件下，考察不同提取溫度對多糖提取率的影響。

3.談判技術(shù)。談判是指有關(guān)組織或個人以口頭語言為載體，對涉及自身利益的分歧和沖突進(jìn)行反復(fù)磋商，尋求解決途徑和謀求達(dá)成協(xié)議的過程，它是知識、信息、口才、修養(yǎng)等諸方面的較量和角逐。［3］人類社會誕生至今就無時無刻不充斥著利益沖突，在這個意義上，人類的歷史就是一部談判的歷史。

2.1.6 提取時間對多糖提取率的影響 在料液比1∶40、馬齒莧-肉桂配比12∶5、提取溫度100 ℃的條件下，考察不同提取時間對多糖提取率的影響。

2.1.7 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為考察指標(biāo)，以L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)[10]，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 馬齒莧-肉桂提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

2.2 動物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 分組及給藥方法 昆明種雄性小鼠60只，隨機(jī)分6組(每組小鼠體質(zhì)量進(jìn)行方差分析，P>0.05)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。分為空白組、UC模型組、柳氮磺胺吡啶組[11]、馬齒莧-肉桂低中高劑量組?？瞻捉M小鼠飲用純凈水，其他小鼠自飲3%DSS 9 d誘導(dǎo)UC模型[12]，造模第1天起記錄小鼠的體質(zhì)量、大便質(zhì)地、潛血或便血特征[13-15]，根據(jù)表3進(jìn)行疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分。

UC模型建立成功，第10天開始給藥治療，空白組和模型組灌胃5% 0.9%氯化鈉溶液，每天1 mL；柳氮磺胺吡啶組灌胃300 mg·kg-1的柳氮磺胺吡啶混懸液；馬齒莧-肉桂低劑量組、中劑量組、高劑量組分別灌胃100、200、400 mg·kg-1的多糖水溶液(馬齒莧-肉桂的水提粉末依據(jù)最優(yōu)多糖提取率19%換算而成)[16]，每天1 mL；灌胃7 d，最后一次灌胃完禁食1 d。乙醚麻醉，眼眶取血，3000 r·min-1離心10 min，吸取血清，-20 ℃保存，待測ELISA試劑盒使用；距離肛門5 cm處取小鼠結(jié)腸段約1 cm，4%多聚甲醛保存。

2.2.2 石蠟包埋和HE染色 將保存的結(jié)腸組織取出后在流水中沖洗1 h，再將組織標(biāo)本放入乙醇中梯度脫水各1 h，再用二甲苯(2缸)透明1 h，然后將透明后的標(biāo)本放置在65 ℃熔解狀態(tài)的石蠟中1 h，浸透后取出組織放置于包埋模具內(nèi)熔蠟填充制得石蠟塊，并放于病理冷凍臺15 min后取下固定于切片機(jī)標(biāo)本架上，進(jìn)行4 μm厚度連續(xù)切片，將切片放入45 ℃的恒溫水浴箱中使其充分鋪開以裱片，然后移入60 ℃恒溫干燥箱中2 h，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

病理HE染色，將烤好的切片用二甲苯脫蠟2次(每次15 min)，然后依次放入濃度梯度的乙醇和蒸餾水中各8 min，再將切片移入蘇木素染液中3 min，然后用流水洗去蘇木素染液終止染色，待其干后放入1%鹽酸乙醇溶液分化3 s，再以流水沖洗10 min后返藍(lán)25 min，然后放入伊紅液染色2 min并快速水洗以終止染色，最后將切片依次放入濃度梯度的乙醇中脫水5 min后，放入二甲苯透明2次(每次 3 min)后擦去殘余的二甲苯，滴加中性樹膠并蓋玻片封片固定。在微鏡下觀察比較各組大鼠HE染色結(jié)腸組織損傷的病理變化，并予評分比較(HAI=上皮組織破壞分?jǐn)?shù)+炎性浸潤分?jǐn)?shù))。具體參考Cooper等[17]的評分標(biāo)準(zhǔn)予以分析比較，見表2。

表2 大鼠結(jié)腸組織HAI病理變化評分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.3 DAI評分標(biāo)準(zhǔn) DAI=(體質(zhì)量下降評分+大便性狀評分+大便隱血情況評分)/3，評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 DAI評分表

注：正常大便：成形大便；松散大便：不黏附于肛口的，糊狀或半成形大便；稀便：可黏附于肛門的稀水樣便。采用聯(lián)苯胺法檢測大便隱血。

2.2.4 IL-10、TNF-α含量測定 按照小鼠ELISA試劑盒說明書測定小鼠血清中IL-10、TNF-α的含量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)

根據(jù)表4～7結(jié)果，可以得出馬齒莧和肉桂12∶5時，提取率較高；料液比1∶40時提取率最高；隨著溫度的升高，提取率也在上升；提取時間1、2、4、5 h時，提取率增加幅度很?。惶崛?～4 h時，隨著提取時間的延長，提取率增加。

表4 馬齒莧-肉桂配比對多糖提取率的影響

表5 料液比對多糖提取率的影響

表6 提取溫度對多糖提取率的影響

表7 提取時間對多糖提取率的影響

3.2 正交試驗(yàn)

由表8正交試驗(yàn)結(jié)果得出最優(yōu)工藝是A3B1C3D2，即馬齒莧和肉桂12∶5，料液比1∶30，提取時間5 h，提取溫度90 ℃。由R值可以看出C(提取時間)因素對多糖提取率的影響最大。4個因素對多糖提取率影響的大小如下：C(提取時間)>B(料液比)>D(提取溫度)>A(配比)；表9方差結(jié)果分析可得出4個因素間無統(tǒng)計學(xué)差異，從提取效率角度選用方案為馬齒莧和肉桂12∶5、料液比1∶30、提取時間5 h、提取溫度90 ℃。

表8 馬齒莧-肉桂提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

表9 馬齒莧-肉桂提取工藝正交試驗(yàn)方差分析

注：F0.05(2，2)=19，F(xiàn)0.01(2，2)=99。

3.3 最優(yōu)工藝的確定

根據(jù)正交試驗(yàn)的最優(yōu)工藝進(jìn)行提取，平行實(shí)驗(yàn)3次，測其多糖提取率，結(jié)果多糖提取率分別為18.85%、19.14%、19.27%，RSD=0.92%。結(jié)果表明，優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定。

3.4 DAI評分結(jié)果

根據(jù)表3小鼠DAI評分表，得出表10評分結(jié)果，小鼠自飲3% DSS 9 d后各實(shí)驗(yàn)組DAI評分均升高，表明小鼠造模成功，第10天灌胃治療，給藥組小鼠DAI評分均呈下降趨勢，且隨給藥濃度的增大，小鼠DAI評分下降趨勢更明顯，然而不及陽性對照藥的療效，表明馬齒莧-肉桂聯(lián)用對UC有療效，且比馬齒莧單味藥的療效更確切[6]。

表10 馬齒莧-肉桂配伍各組小鼠的DAI評分 分

注：與UC模型組比較，**P<0.01，*P<0.05；與空白組比較，##P<0.01，#P<0.05。

3.5 炎癥因子的變化

由表11可知，模型組血清中抑炎因子IL-10的含量較空白組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，促炎因子TNF-α含量較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。給藥后，馬齒莧-肉桂低、中劑量組IL-10的含量較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且高于陽性對照組，相比馬齒莧單味藥治療，IL-10的含量增加很多[6]；馬齒莧-肉桂低、中、高劑量組TNF-α含量較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，相比馬齒莧單味藥治療，TNF-α的含量降低幅度更明顯[7]，較柳氮磺胺吡啶組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明馬齒莧-肉桂聯(lián)用能顯著改變UC小鼠炎癥因子的含量，且比馬齒莧治療效果更佳，治療效果與陽性對照藥無明顯差異。

表11 馬齒莧-肉桂配伍各組小鼠IL-10、TNF-α含量的變化 pg·mL-1

注：與UC模型組比較，**P<0.01，*P<0.05；與空白組比較，##P<0.01，#P<0.05。

3.6 結(jié)腸組織觀察

乙醚麻醉，處死小鼠，從肛門以上5 cm處取出小鼠結(jié)腸段約1 cm，發(fā)現(xiàn)空白對照組小鼠結(jié)腸顏色為淡紅色，腸管內(nèi)充滿成形糞便。DSS模型組小鼠結(jié)腸腸壁充血腫脹，嚴(yán)重者整個結(jié)腸段為血性腸內(nèi)容物。給藥組小鼠可見基本成型糞便，結(jié)腸腸壁有輕微充血。從圖1、2進(jìn)一步得出：空白組結(jié)腸組織完整，包括黏膜層、黏膜下層、肌層，可見明顯的隱窩和杯狀細(xì)胞，腺體排列整齊；DSS誘導(dǎo)的UC模型組，部分腸黏膜層不完整脫落，隱窩和杯狀細(xì)胞明顯減少，有大量炎癥因子，主要是中性粒細(xì)胞侵入黏膜層，HAI評分明顯高于空白組，表明UC模型誘導(dǎo)成功；陽性對照組柳氮磺胺吡啶治療后，結(jié)腸結(jié)構(gòu)相對完整，有大量杯狀細(xì)胞和隱窩出現(xiàn)，但黏膜層仍有少量炎癥細(xì)胞，HAI評分顯著降低，表明磺胺吡啶300 mg·kg-1可改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀，然而，炎癥細(xì)胞浸潤對結(jié)腸組織的損傷并沒有完全消除；馬齒莧-肉桂給藥100、200、400 mg·kg-1的多糖水溶液治療，可見結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，有隱窩和大量杯狀細(xì)胞出現(xiàn)，但仍有少量炎癥細(xì)胞浸潤，HAI評分較模型組顯著降低，但不及陽性藥的療效，表明馬齒莧-肉桂可修復(fù)UC結(jié)腸組織，但是不能完全消除炎癥因子對結(jié)腸組織的損傷。相比汪荔[7]研究，雖給藥量減少，然而治療效果卻得到很大的改善，進(jìn)一步表明馬齒莧-肉桂聯(lián)用對UC療效甚好。

圖1 小鼠結(jié)腸組織HE染色圖(×400，橫切)

注：與UC模型組比較，**P<0.01，*P<0.05；與空白組比較，##P<0.01，#P<0.05。圖2 小鼠結(jié)腸組織病理切片HAI評分(n=6)

4 討論

多糖提取工藝從馬齒莧-肉桂的配比、料液比、提取時間、提取溫度4個因素研究，以多糖提取率為考察指標(biāo)篩選最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案。即馬齒莧和肉桂12∶5，料液比1∶30，提取時間5 h，提取溫度90 ℃為最優(yōu)提取工藝條件。用3%DSS誘導(dǎo)昆明種小鼠UC模型，從DAI評分可得出小鼠給藥后體征恢復(fù)正常；病理切片可看出小鼠給藥后結(jié)腸組織有所改善；炎癥因子數(shù)據(jù)表明小鼠給藥前后抑炎因子和促炎因子的變化，進(jìn)一步證實(shí)藥物對小鼠UC模型有治療作用。

前期課題組研究了馬齒莧對DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠有確切的治療作用，可明顯改善小鼠結(jié)腸組織病理結(jié)構(gòu)。馬齒莧性寒，多糖是其主要活性成分，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用[18]，具有“天然抗生素”的美稱[19]。馮瀾等[20]研究表明馬齒莧多糖可以提高抗炎細(xì)胞因子 IL-10 的水平并降低致炎細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6 的水平，同時可以提高雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量，因此馬齒莧多糖通過抗炎和降低腸道過度的免疫反應(yīng)以及調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)失調(diào)，對潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)揮治療作用。肉桂性辛、甘、熱，其所含的成分如總酚類物質(zhì)、槲皮苷、山柰酚被證明無論在體內(nèi)還是體外試驗(yàn)中均具有很好的抗腫瘤作用[21]。有研究表明肉桂對潰瘍性結(jié)腸炎治療作用的分子機(jī)制可能是由于其對基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的抑制。馬齒莧性寒，單味藥治療UC不能發(fā)揮其最大的療效，因此配伍肉桂研究了馬齒莧-肉桂最佳提取工藝、3%DSS誘導(dǎo)UC模型，小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)、DAI評分、IL-10和TNF-α的含量變化、結(jié)腸組織病理切片，表明馬齒莧-肉桂聯(lián)用對UC有療效，且比馬齒莧單味藥療效更佳[6]。我國UC患者逐年上升，因此研發(fā)有效安全、不良反應(yīng)小的藥物尤為重要。本實(shí)驗(yàn)僅研究了提取工藝及其在動物水平的療效，在今后將研究其在細(xì)胞、分子和基因水平的治療機(jī)制，為我國治療UC提供更多選擇。