蜈蚣草二萜類化學成分及其抗炎活性△

周艷麗，王大利，張艷*，張寧，李碩熙，吳嬌，李楊

1.黑龍江中醫(yī)藥大學 佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.大連市兒童醫(yī)院 中心實驗室，遼寧 大連 116012；3.大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 116600

蜈蚣草為鳳尾蕨科Pteridaceae鳳尾蕨屬Pteris植物，別名蜈蚣蕨、舒筋草、長葉甘草蕨等。蜈蚣草喜暖、半陰和潮潤的環(huán)境，廣泛分布于我國南方地區(qū)，具有較高的觀賞價值和藥用價值[1]?！度珖胁菟巺R編》記載：其性味淡、平，具有解毒殺蟲、祛風活血之功；民間多用于治療流行性感冒、痢疾、疳瘡、風濕疼痛、跌打損傷等?，F(xiàn)代研究表明，蜈蚣草含有黃酮、多糖、多酚類化合物等，其提取物具有抗氧化、抑菌活性[2-4]。課題組前期對多種鳳尾蕨屬藥用植物進行化學成分研究，發(fā)現(xiàn)多種二萜類化學成分[5-6]。蜈蚣草屬于鳳尾蕨屬藥用植物，然而其化學成分及生物活性的研究報道較少[7]。因此，為明確蜈蚣草的活性成分，本實驗對蜈蚣草的化學成分進行深入的研究，分離并鑒定了6個化合物，分別鑒定為ent-3β-hydroxy-kaur-16-ene(1)，ent-3β-acetoxy-kaur-16-ene(2)，7β，17-dihydroxy-16β-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranosideester(3)，7β，17-dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester(4)，crotonkinin C(5)，crotonkinin D(6)；并進一步通過脂多糖誘導RAW264.7細胞炎癥模型對各化合物的抗炎活性進行了評價，為后續(xù)研究蜈蚣草藥物資源的化學成分、藥理活性及開發(fā)利用提供科學參考。

1 儀器與試藥

BRUKER AV500-III核磁共振儀(布魯克公司，德國)，溶劑峰為內(nèi)標；島津Shimadazu LC-6AD，SPD紫外檢測器(Shimadazu公司，日本)；色譜柱：YMC C18(500 mm×50 mm，50m，YMC公司，日本)；Sephadex LH-20(GE Healthcare公司)；反相柱色譜硅膠RP-18(50m，75m，日本YMC公司)；CHP 20P型MCI吸附樹脂(日本三菱公司)；Multiskan FC酶標儀(美國Thermo-Fisher公司)。

實驗用蜈蚣草于2017年8月采集于云南西雙版納地區(qū)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學陳效忠副教授鑒定為鳳尾蕨屬Pteris植物蜈蚣草Pterisvittata的全草。藥材標本保存于黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院標本館。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取和分離

蜈蚣草的干燥全草共10 kg，用95%的乙醇溶液(8 L)回流提取3次，每次2 h，提取液合并后經(jīng)真空干燥去除溶劑，得到干浸膏共950 g。將浸膏加水混懸分散，然后分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取分段。乙酸乙酯萃取液經(jīng)真空濃縮干燥，得到乙酸乙酯層浸膏60.0 g，該部分經(jīng)硅膠柱層析初步分離，用二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)(1∶0～0∶1)進行梯度洗脫，最后再用甲醇洗脫，共收集得到6個組分，分別為Fr.A～F。Fr.D經(jīng)MCI柱層析分離，洗脫劑為甲醇-水系統(tǒng)(20∶80，30∶70，40∶60，50∶50，60∶40，70∶30，100∶0)，進一步分成5個亞組分Subfr.D1～D5。Subfr.D3先后經(jīng)C18反相柱層析(MeOH-H2O，25∶75～50∶50)和LH-20凝膠柱層析(MeOH-H2O，50∶50)分離純化得到化合物1(5 mg)和化合物2(8 mg)。Subfr.D5通過與Subfr.D3相同的分離手段和程序，分離純化得到了化合物5(12 mg)和化合物6(15 mg)。Subfr.D4先經(jīng)C18反相柱層析(MeOH-H2O，35∶65～80∶20)初步分離，再用制備型高效液相色譜法進行純化，最后得到化合物3(12 mg)和化合物4(15 mg)。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末。根據(jù)ESI-MS在m/z389處顯示出準分子離子峰[M+H]+，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)，確定其分子式為C20H32O。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：1.85(1H，ddd，J=13.2 Hz，J=3.7 Hz，J=3.4 Hz，H-1a)，0.90(1H，ddd，J=13.2 Hz，J=12.4 Hz，J=5.2 Hz，H-1b)，1.63(1H，m，H-2a)，1.60(1H，m，H-2b)，3.19(1H，dd，J=10.9 Hz，J=5.6 Hz，H-3)，0.76(1H，dd，J=11.8 Hz，J=1.9 Hz，H-5)，1.55(1H，m，H-6a)，1.40(1H，m，H-6b)，1.52(1H，m，H-7a)，1.48(1H，m，H-7b)，1.03(1H，m，H-9)，1.62(1H，m，H-11a)，1.53(1H，m，H-11b)，1.98(1H，dm，J=11.4 Hz，H-12a)，1.11(1H，dddd，J=11.4 Hz，J=5.1 Hz，J=1.8 Hz，J=1.6 Hz，H-12b)，2.64(1H，m，H-13)，1.62(1H，m，H-14a)，1.48(1H，m，H-14b)，2.06(1H，m，H-15a)，2.05(1H，m，H-15b)，4.80(1H，m，H-17a)，4.74(1H，m，H-17b)，0.98(H，s，H-18)，0.78(H，s，H-19)，1.02(H，s，H-20)；13C-NMR(CDCl3，125 MHz)δ：38.7(C-1)，27.4(C-2)，79.1(C-3)，38.9(C-4)，55.2(C-5)，20.0(C-6)，41.2(C-7)，44.0(C-8)，55.9(C-9)，39.1(C-10)，18.3(C-11)，39.8(C-12)，43.97(C-13)，33.2(C-14)，49.0(C-15)，155.8(C-16)，103.0(C-17)，28.4(C-18)，15.5(C-19)，17.6(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻基本一致[8]，故鑒定化合物為對映-3β-羥基-貝殼杉-16-烯(ent-3β-hydroxy-kaur-16-ene)，化學結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物2：白色粉末。根據(jù)ESI-MS在m/z330處顯示出準分子離子峰[M+H]+，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)，確定其分子式為C22H34O2。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：1.85(1H，ddd，J=13.4 Hz，J=3.8 Hz，J=3.5 Hz，H-1a)，0.98(1H，ddd，J=13.4 Hz，J=12.8 Hz，J=4.7 Hz，H-1b)，1.67(1H，m，H-2a)，1.65(1H，m，H-2b)，4.47(1H，dd，J=11.1 Hz，J=5.5 Hz，H-3)，0.85(1H，m，H-5)，1.53(1H，m，H-6a)，1.36(1H，m，H-6b)，1.53(1H，m，H-7a)，1.51(1H，m，H-7b)，1.06(1H，m，H-9)，1.64(1H，m，H-11a)，1.54(1H，m，H-11b)，1.97(1H，dm，J=11.4 Hz，H-12a)，1.11(1H，dddd，J=11.4 Hz，J=5.0 Hz，J=1.8 Hz，J=1.6 Hz，H-12b)，2.64(1H，m，H-13)，1.64(1H，m，H-14a)，1.48(1H，m，H-14b)，2.07(1H，m，H-15a)，2.06(1H，m，H-15b)，4.79(1H，m，H-17a)，4.74(1H，m，H-17b)，0.86(H，s，H-18)，0.85(H，s，H-19)，1.05(H，s，H-20)，2.04(3H，s，CH3COO-)；13C-NMR(CDCl3，125 MHz)δ：38.4(C-1)，23.7(C-2)，81.1(C-3)，37.9(C-4)，55.4(C-5)，19.9(C-6)，41.1(C-7)，44.1(C-8)，55.9(C-9)，39.0(C-10)，18.3(C-11)，39.8(C-12)，44.0(C-13)，33.0(C-14)，49.0(C-15)，155.7(C-16)，103.1(C-17)，28.4(C-18)，16.6(C-19)，17.7(C-20)，171.0(CH3COO-)，21.3(CH3COO-)。以上數(shù)據(jù)與文獻基本一致[8]，故鑒定化合物為對映-3β-乙酰氧基-貝殼杉-16-烯(ent-3β-acetoxy-kaur-16-ene)，化學結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物3：白色粉末。根據(jù)ESI-MS 在m/z937處顯示出準分子離子峰[M+H]+，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)，確定其分子式為C43H68O22。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：1.77(1H，m，H-1a)，0.75(1H，m，H-1b)，2.22(1H，m，H-2a)，1.42(1H，m，H-2b)，2.38(1H，m，H-3a)，1.89(1H，m，H-3b)，1.05(1H，m，H-5)，2.40(1H，m，H-6a)，1.98(1H，m，H-6b)，1.43(1H，m，H-7a)，1.36(1H，m，H-7b)，0.91(1H，m，H-9)，1.68(1H，m，H-11)，2.19(1H，m，H-12a)，1.89(1H，m，H-12b)，2.55(1H，m，H-14a)，1.74(1H，m，H-14b)，2.14(1H，m，H-15a)，2.06(1H，m，H-15b)，5.6(1H，brs，H-17a)，5.2(1H，brs，H-17b)，1.27(3H，s，H-18)，1.25(3H，s，H-20)，6.10(1H，d，J=7.0 Hz，Glc-1)，4.96(1H，d，J=7.3 Hz，Xyl-1)，5.54(1H，d，J=7.7 Hz，glc2-1(Xyl)，5.33[1H，d，J=7.8 Hz，glc3-1(Xyl)]；13C-NMR(CDCl3，125 MHz)δ：40.1(C-1)，19.9(C-2)，38.9(C-3)，44.4(C-4)，57.8(C-5)，22.6(C-6)，42.2(C-7)，44.7(C-8)，54.7(C-9)，40.2(C-10)，20.9(C-11)，38.4(C-12)，87.2(C-13)，44.7(C-14)，48.5(C-15)，154.7(C-16)，105.4(C-17)，29.0(C-18)，177.3(C-19)，16.1(C-20)，96.3(Glc-1)，98.7(Xyl-1)，105.0[glc2-1(Xyl))，105.1 glc3-1(Xyl)]。以上數(shù)據(jù)與文獻基本一致[9]，故鑒定化合物為13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-xylopyranosyl)-oxy]ent-kaur-16-en-19-oic acidβ-D-glucopy-ranosyl ester，化學結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物4：白色粉末。根據(jù)ESI-MS在m/z935處顯示出準分子離子峰[M+H]+，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)，確定其分子式為C44H70O21。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：1.66(1H，m，H-1a)，0.76(1H，m，H-1b)，2.11(1H，m，H-2a)，1.70(1H，m，H-2b)，2.15(1H，m，H-3a)，1.91(1H，m，H-3b)，1.00(1H，m，H-5)，2.11(1H，m，H-6a)，1.86(1H，m，H-6b)，1.62(1H，m，H-7a)，1.32(1H，m，H-7b)，0.91(1H，m，H-9)，1.70(1H，m，H-11)，2.68(1H，m，H-12a)，1.15(1H，m，H-12b)，2.50(1H，m，H-14a)，1.70(1H，m，H-14b)，2.10(1H，m，H-15)，5.72(1H，s，H-17a)，5.10(1H，m，H-17b)，1.50(1H，s，H-18)，1.14(1H，s，H-20)，6.24(1H，d，J=6.8 Hz，Glc-1)，6.40(1H，d，J=5.6 Hz，Rha2-1)，5.10(1H，d，J=6.8 Hz，Glc-1)，5.22(1H，d，J=6.6 Hz，glc2-1)；13C-NMR(CDCl3，125 MHz)δ：41.1(C-1)，20.3(C-2)，38.1(C-3)，44.8(C-4)，58.8(C-5)，22.5(C-6)，42.1(C-7)，43.1(C-8)，54.4(C-9)，40.2(C-10)，21.1(C-11)，38.1(C-12)，86.6(C-13)，45.1(C-14)，48.3(C-15)，155.1(C-16)，105.6(C-17)，29.6(C-18)，176.0(C-19)，17.3(C-20)，94.1(Glc-1)，102.0(Rha2-1)，98.5(Glc-1)，107.0(Glc2-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻基本一致[9]，故鑒定化合物為13-[(2-O-α-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]ent-kaur-16-en-19-oic acid 2-O-α-L-rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranosyl ester，化學結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物5：白色粉末。根據(jù)ESI-MS在m/z391處顯示出準分子離子峰[M+H]+，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR 數(shù)據(jù)，確定其分子式為C22H30O6。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：1.99(1H，m，H-1a)，0.99(1H，m，H-1b)，2.01(1H，m，H-2a)，1.49(1H，m，H-2b)，1.76(1H，m，H-3)，1.76(1H，m，H-5)，1.59(1H，m，H-6a)，0.99(1H，m，H-6b)，2.18(1H，brd，J=11.0 Hz，H-7a)，1.59(1H，m，H-7b)，1.37(1H，brs，H-9)，5.17(1H，d，J=5.4 Hz，H-11)，1.88(1H，m，H-12a)，1.66(1H，m，H-12b)，2.99(1H，m，H-13)，1.88(1H，m，H-14)，6.60(1H，s，H-15)，9.75(1H，s，H-17)，1.18(3H，s，H-19)，1.08(3H，s，H-20)，1.90(3H，s，H-22)；13C-NMR(CDCl3，125 MHz)δ：38.6(C-1)，21.7(C-2)，36.8(C-3)，47.3(C-4)，49.4(C-5)，17.5(C-6)，42.2(C-7)，49.5(C-8)，55.4(C-9)，38.3(C-10)，68.1(C-11)，37.1(C-12)，36.1(C-13)，34.4(C-14)，162.1(C-15)，150.7(C-16)，189.2(C-17)，182.7(C-18)，16.2(C-19)，18.0(C-20)，169.4(C-21)，21.4(C-22)。以上數(shù)據(jù)與文獻基本一致[10]，故鑒定化合物為越南巴豆素C(crotonkinin C)，化學結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物6：白色粉末。根據(jù)ESI-MS在m/z435處顯示出準分子離子峰[M+H]+，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR 數(shù)據(jù)，確定其分子式為C24H34O7。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：1.98(1H，m，H-1a)，0.86(1H，m，H-1b)，1.48(1H，m，H-2a)，1.36(1H，m，H-2b)，1.36(1H，m，H-3)，1.15(1H，d，J=10.7 Hz，H-5)，1.65(1H，m，H-6a)，1.48(1H，m，H-6b)，1.71(1H，m，H-7)，1.25(1H，brs，H-9)，5.17(1H，d，J=3.7 Hz，H-11)，1.94(1H，m，H-12)，2.89(1H，m，H-13)，2.17(1H，d，J=10.9 Hz，H-14a)，1.65(1H，m，H-14b)，6.64(1H，s，H-15)，3.87(1H，d，J=11.0 Hz，H-18a)，3.63(1H，d，J=11.0 Hz，H-18b)，0.82(3H，s，H-19)，1.08(3H，s，H-20)，1.93(3H，s，H-22)，2.07(3H，s，H-24)；13C-NMR(CDCl3，125 MHz)δ：39.0(C-1)，18.5(C-2)，35.6(C-3)，36.5(C-4)，49.3(C-5)，17.5(C-6)，37.3(C-7)，49.1(C-8)，55.0(C-9)，38.8(C-10)，68.6(C-11)，34.4(C-12)，38.5(C-13)，42.3(C-14)，156.9(C-15)，139.6(C-16)，169.0(C-17)，72.6(C-18)，17.4(C-19)，18.1(C-20)，169.6(C-21)，21.4(C-22)，171.3(C-23)，21.0(C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻基本一致[10]，故鑒定化合物為越南巴豆素D(crotonkinin D)，化學結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～6化學結(jié)構(gòu)

2.3 抗炎實驗

將C57BL6/J小鼠的巨噬細胞以RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)在48孔細胞培養(yǎng)板中，37℃ 條件下培養(yǎng)24 h。然后將細胞分為4組(全部生長于RPMI1640培養(yǎng)基中)：空白對照組(只加入RPMI1640培養(yǎng)基)、脂多糖對照組(加入1 mg·mL-1的脂多糖)、實驗對照組(加入了1 mg·mL-1的脂多糖和候選化合物)和陽性對照組(加入10-6mol·L-1地塞米松)。將這些細胞在37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在100 mL的上清液中分別加入等量的格里斯試劑，并用酶標儀在波長570 nm下進行檢測，以亞硝酸鈉作為計算NO2-濃度的標準[11]。

結(jié)果表明化合物1和2具有較強的抑制NO產(chǎn)生作用，IC50值分別為9.5、8.3 μmol·L-1，且在測試濃度范圍內(nèi)具有較好的劑量依賴關(guān)系；而其他化合物均無明顯的抗炎活性。