雛雞關(guān)節(jié)炎型沙門氏菌GZ2018株的分離鑒定

楊佰啟， 溫貴蘭*， 陳彥希， 田 浪， 張升波，徐 麗， 李昌紅， 龔新勇， 文 明， 周碧君， 張 軍.3

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州省六盤水市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，貴州 六盤水 553000)

病原沙門氏菌屬(Salmonella)為寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的無芽孢桿菌，是一大屬與血清學(xué)相關(guān)的革蘭氏陰性桿菌[1]。SALMON于1985年分離出沙門氏菌屬的豬霍亂桿菌，因此定名沙門氏菌屬Salmonella[2]。目前，沙門氏菌屬有2個(gè)種，42個(gè)血清群，2 500個(gè)血清型以上，我國已報(bào)道的血清型達(dá)240種以上[3]，其中與家禽密切相關(guān)的有40余種。雞沙門氏菌病(AvianSalmonellosis)是由多種沙門氏菌引起的一類傳染病的總稱，其中引起雞發(fā)病的沙門氏菌主要有雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌及有鞭毛能運(yùn)動(dòng)的多種副傷寒沙門氏菌[4]；大多數(shù)禽類對(duì)沙門氏菌病易感，以3周齡以內(nèi)雛雞的發(fā)病率與病死率最高，4周齡后的發(fā)病率和死亡率顯著下降[5]。臨床上多表現(xiàn)為敗血癥和腸炎，少數(shù)表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎；雞沙門氏菌病對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害較大，會(huì)導(dǎo)致雞的生產(chǎn)性能下降，種蛋的孵化率降低。目前，我國控制該病的主要措施是檢疫淘汰帶菌雞，凈化培育雞群；對(duì)于一些沒有條件凈化或短期內(nèi)無法凈化的雞群采用抗菌藥物預(yù)防和治療[6-7]。筆者等2018年11月對(duì)貴州某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的病雞進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定，通過藥敏試驗(yàn)篩選出分離菌株的敏感藥物，并進(jìn)行分離菌株16S rRNA基因序列分析鑒定，確診送檢病雞為雞沙門氏菌感染，對(duì)該雞場(chǎng)雞沙門氏菌的防控具有指導(dǎo)作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料與健康雛雞病料5份，來源于貴州某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)處于3～4周齡發(fā)病的5只雛雞。健康雛雞8只，購自貴州某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2主要試劑普通肉湯瓊脂平板、普通肉湯液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MAC)、亞硫酸鉍(BS)瓊脂平板、革蘭氏染色劑、抗菌藥物(紅霉素、先鋒霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、丁胺卡那、新霉素、氯霉素、慶大霉素、多黏霉素、克林霉素、四環(huán)素、萬古霉素、諾氟霉素、卡那霉素、青霉素)、革蘭氏染色劑、生化管，均購自杭州微生物試劑公司；2×Es Taq DNA polymerase，購自康為世紀(jì)；DL 2000 DNA Marker，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)無菌采集病雞關(guān)節(jié)液，用接種環(huán)接種于普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基，分別在需氧與厭氧條件下37℃培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)菌菌落特征。挑取可疑單個(gè)菌落分別接種于麥康凱培養(yǎng)基(MAC)、亞硫酸鉍(BS)瓊脂平板上。

1.2.2細(xì)菌革蘭氏染色取50 μL純培養(yǎng)菌液均勻涂抹于干凈載玻片上，經(jīng)火焰固定、草酸結(jié)晶紫初染、碘液媒染、脫色液脫色、沙黃復(fù)染后，于10×100倍油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3細(xì)菌生化試驗(yàn)用接種環(huán)分別接種純培養(yǎng)菌液于麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、甲基紅、吲哚(靛基質(zhì))、乳糖生化管中，37℃培養(yǎng)48 h后觀察記錄結(jié)果。

1.2.4細(xì)菌藥敏試驗(yàn)吸取100 μL純培養(yǎng)菌液均于涂抹于瓊脂平板上，用紙片法將15種藥敏片粘貼于平板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄藥敏片的抑菌圈大小，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI 2016)抗微生物藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性判斷。

1.2.5分離菌株感染雛雞試驗(yàn)將8只健康雛雞平均分為2組，試驗(yàn)組肌肉注射200 μL菌液，對(duì)照組肌肉注射200 μL生理鹽水，隔離飼養(yǎng)，觀察雛雞發(fā)病和死亡情況，采集關(guān)節(jié)液接種于普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落涂片鏡檢。

1.2.6分離菌株16S rRNA PCR 擴(kuò)增及測(cè)序細(xì)菌16S rRNA引物序列，F(xiàn)：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序合成。PCR反應(yīng)體系20 μL：上游引物0.5 μL，下游引物 0.5 μL，菌液 2 μL，2×Es Taq DNA polymerase 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)1.2%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物，并將產(chǎn)物送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。

1.2.7分離菌株16S rRNA基因序列分析將分離菌株的16S rRNA基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中收錄的序列進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用DNAStar 7.0軟件的MegAlign將測(cè)序的16S rRNA基因序列與腸桿菌科沙門氏菌屬、大腸桿菌屬共17個(gè)菌株(表1)的16S rRNA基因序列比對(duì)，并應(yīng)用MegAlign軟件的Cluster W方法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

表1 比對(duì)菌株信息

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)

接種分離菌37℃培養(yǎng)24 h后，在亞硫酸鉍瓊脂平板上顯示黑色并有金屬光澤的菌落，菌落周圍培養(yǎng)基不變；在麥康凱瓊脂平板上生長(zhǎng)成無色、半透明、表面光滑的圓形小菌落(圖1)。該菌在2種平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)均符合沙門氏菌的生長(zhǎng)特性。

圖1亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基(上)與麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(下)培養(yǎng)分離菌的特征

Fig.1 Characteristics of the isolated strain cultured on Bismuth sulfite agar medium (up) and Mackenzie agar medium (down)

2.2細(xì)菌革蘭氏染色與生化反應(yīng)

分離菌經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌(圖2)，符合沙門氏菌屬革蘭氏染色的細(xì)菌形態(tài)。經(jīng)生化試驗(yàn)，分離菌可以發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；不發(fā)酵乳糖，甲基紅試驗(yàn)陽性(+)，吲哚(靛基質(zhì))弱陽性(+/-)，符合沙門氏菌的生化反應(yīng)特征。

圖2 細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果

2.3分離菌的藥物敏感性

從表2看出，分離菌對(duì)紅霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、丁胺卡那、氯霉素、慶大霉素和多黏霉素高度敏感；對(duì)先鋒霉素V、新霉素和克林霉素中度敏感；對(duì)青霉素、四環(huán)素、萬古霉素、諾氟霉素和卡那霉素不敏感(產(chǎn)生耐藥性)。

表2分離菌對(duì)15種抗菌藥物的敏感性

Table 2 Sensibility of the isolated strain to 15 antibacterial agents

藥物名稱Drug name抑制菌圈直徑大小/mmDiameter of inhibition zone判定結(jié)果Evaluation result紅霉素 Eryphilin30高度敏感先鋒霉素V Pioneer V20中度敏感青霉素 penicillin10不敏感四環(huán)素 tetracycline12不敏感頭孢曲松 Ceftriaxone 46高度敏感克林霉素 Clindamycin15中度敏感萬古霉素 Vancomycin10不敏感環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin24高度敏感丁胺卡那 Amikacin30高度敏感新霉素 Neomycin20中度敏感氯霉素 Chloramphenicol40高度敏感慶大霉素 Gentamicin25高度敏感諾氟霉素 Norfomycin12不敏感卡那霉素 Kanamycin10不敏感多黏霉素B Polymyxin B23高度敏感

2.4雛雞感染試驗(yàn)

試驗(yàn)組雛雞感染分離菌3 d后，病雞表現(xiàn)精神沉郁，食欲不振，病初喜臥，隨后出現(xiàn)跛行，一側(cè)或雙側(cè)關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫大。剖解病雞關(guān)節(jié)腔、腿肌及腹腔，可見腿肌處淡黃色滲出液，關(guān)節(jié)及附近滑液囊高度腫大，與之相連接的腱鞘發(fā)炎腫大，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有黃色或淡黃色的液體滲出，囊壁增厚，腹腔內(nèi)有大量淡黃色積液，心包膜增厚。對(duì)照組7 d無異?，F(xiàn)象。接種試驗(yàn)組雛雞分離菌涂片鏡檢，與沙門氏菌的形態(tài)特征一致，證明導(dǎo)致雛雞感病的病原為沙門氏菌。

2.5分離菌株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增與及測(cè)序

從圖3可知，分離菌株的16S rRNA基因 PCR擴(kuò)增片段約為1 300 bp。目的條帶測(cè)序得到分離菌株16S rRNA基因的部分序列，大小為950 bp，命名該菌株為GZ2018。

注：M為2000 DMarker，1為分離菌株，2為陰性對(duì)照。

Note: M. 2000 D marker; 1. The isolated strain; 2. Negative control.

圖3分離沙門氏菌的16SrRNAPCR擴(kuò)增圖譜

Fig.3 16S rRNA PCR amplification pattern of the isolatedSalmonellastrain

2.6沙門氏菌GZ2018的16S rRNA基因序列

2.6.1同源性從圖4看出，沙門氏菌GZ2018與沙門氏菌屬和大腸桿菌屬的17株細(xì)菌16S rRNA基因序列同源性為40.9%～100%，其中，GZ2018與腸炎型沙門氏菌CQ0709、NBRC 3163和Sal1203的同源性最高，均為100%；與Anatum GT-01株的同源性最低，僅40.9%。

圖4沙門氏菌GZ2018的16S rRNA基因序列同源性對(duì)比

2.6.2系統(tǒng)進(jìn)化樹從圖5可知，Anatum GT-01和Mbandaka.ATCC51958單獨(dú)為一支，其中腸炎型沙門氏菌CQ0709與GZ2018處于同一分支，進(jìn)化關(guān)系最近，進(jìn)一步驗(yàn)證GZ2018為沙門氏菌。

圖5GZ2018株16S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequence ofSalmonellaGZ2018 strain

3結(jié)論與討論

禽沙門氏菌病(PulourmDisease)是由沙門氏菌屬中任何一個(gè)或多個(gè)成員所引起禽類的一種急性或慢性疾病。該病除水平傳播外，主要通過卵傳遞，是貫穿整個(gè)養(yǎng)雞周期的一種惡性循環(huán)式疾病[8]。病雛雞以白痢為特征，雛雞常表現(xiàn)急性敗血癥和腸炎型，病程短，死亡率很高，治療主要以緊急接種為主；關(guān)節(jié)炎型為慢性發(fā)病，臨床上有治療意義，死亡率可以控制在最小范圍內(nèi)[9]。

通過細(xì)菌的分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)、雛雞的致病性試驗(yàn)、PCR反應(yīng)以及16S rRNA基因序列分析，確認(rèn)從發(fā)病雛雞關(guān)節(jié)囊腫分離的細(xì)菌為沙門氏菌。發(fā)生雞關(guān)節(jié)炎性疾病的病原體較多，有細(xì)菌性、病毒性和支原體；常見的病毒性關(guān)節(jié)炎有呼腸孤病毒(ARV)，細(xì)菌性主要有大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌等，支原體性有滑液囊支原體。各種關(guān)節(jié)性疾病通過肉眼難以分辨，為明確病因必需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷確診[5]。試驗(yàn)從貴州某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)3～4周齡發(fā)病雛雞中分離出致病株，分離菌對(duì)紅霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、丁胺卡那、氯霉素、慶大霉素和多黏霉素高度敏感；對(duì)先鋒霉素V、新霉素和克林霉素中度敏感；對(duì)青霉素、四環(huán)素、萬古霉素、諾氟霉素和卡那霉素不敏感，表明該菌已對(duì)多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，在臨床用藥時(shí)應(yīng)該注意聯(lián)合用藥和穿梭用藥。

分離株16S rRNA 基因核苷酸序列與GenBank中其他沙門氏菌的16S rRNA基因序列同源性達(dá)94.6%以上，其中，與CQ0709(GenBank：FJ465088.1)、NBRC 3163(GenBank:AB680018.1)和Sal1203(GenBank：JX888138.1)的同源性為100%；分離菌株與腸炎型沙門氏菌CQ0709(GenBank：FJ465088.1)處于同一小分支上，進(jìn)化關(guān)系最近。綜上所述，貴州某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)3～4周齡雛雞由腸炎型沙門氏菌感染導(dǎo)致發(fā)病。腸炎型沙門氏菌引起雛雞常見的癥狀有精神沉郁、食欲不振、腿軟、下痢，病程稍長(zhǎng)者可引起嚴(yán)重脫水；剖解常見心冠脂肪出血、心包積液，有些肝臟有灰白壞死點(diǎn)，腸道腫大充血、出血[10]；對(duì)于腸炎型沙門氏菌引起關(guān)節(jié)炎型的病例較為少見，故此在臨床診斷時(shí)應(yīng)把腸炎型沙門氏菌納入考慮范圍，再結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷做出準(zhǔn)確的判斷，繼而在短時(shí)間內(nèi)做出預(yù)防與治療方案，減少養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失。試驗(yàn)結(jié)果對(duì)該養(yǎng)殖場(chǎng)雞沙門氏菌的臨床防控與治療具有指導(dǎo)作用。