高活性漆酶菌株 6BS篩選及其對(duì)染料脫色的影響

劉 學(xué)， 王金家， 王艷杰， 于文浩， 邢鑫蕊， 汪春蕾

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

漆酶是屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族的多酚氧化酶[1]。其能通過(guò)氧氣氧化一些芳香族化合物，同時(shí)將分子氧還原為水[2-3]。漆酶在自然界中普遍存在[4]。其中，細(xì)菌和真菌漆酶的應(yīng)用價(jià)值較大，在紙漿造紙、污水處理、木材加工、能源、環(huán)保、生物合成領(lǐng)域均有重要應(yīng)用[5]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上的染料至少10%排放到水體中[6]，其組分復(fù)雜、有機(jī)物含量高、難降解且毒性強(qiáng)[7]，不僅對(duì)水生動(dòng)植物造成危害，還對(duì)人體健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害。目前，處理染料廢水的方法主要有3種。物理法和化學(xué)法具有成本高昂[8]、廢液處理不徹底的缺點(diǎn)[9]，而生物法則具有效率高、能耗低、投資少和環(huán)境友好等特點(diǎn)，成為了近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

細(xì)菌漆酶具有較多的優(yōu)點(diǎn)，如熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，pH適應(yīng)性較廣，對(duì)NaCl和一定濃度的多種有機(jī)溶劑具有較強(qiáng)的耐受性[10]，因此在印染廢水的染料脫色處理中起重大作用。但當(dāng)染料底物的氧化還原電勢(shì)比漆酶高或底物太大以致無(wú)法接近漆酶的催化位點(diǎn)時(shí)，介體與漆酶組成的漆酶介體系統(tǒng)可協(xié)助漆酶完成反應(yīng)，介體因結(jié)構(gòu)的不同而通過(guò)電子傳遞、氫原子傳遞或離子氧化而起作用[11]。

為尋找可用于染料廢水生物處理的高效菌株，特從東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的土壤中分離、篩選出1株具有較高漆酶活性的菌株，對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，研究該菌株的生理、生長(zhǎng)特性，并研究不同類型介體對(duì)芽孢漆酶脫色偶氮、蒽醌、靛藍(lán)及三苯甲烷類染料的影響，以期為工業(yè)染料廢水的處理提供優(yōu)良菌株和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品樣品土壤取自東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)。

1.1.2主要試劑Taq DNA Polymerase、EescherichiacoliJM109感受態(tài)細(xì)胞和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN公司，DNA Marker DL2000、dNTP(2.5 mmol/L)、pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司，16S rDNA通用引物27F和1492R由華大基因公司合成。丁香醛連氮、結(jié)晶紫、靛紅、活性黑和RBBR均購(gòu)自Sigma公司，細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2產(chǎn)漆酶菌株的篩選及純化

用Cu2+為篩選劑純化出單克隆菌株，并以丁香醛連氮為底物，篩選出顏色呈深紅色且具有較高漆酶活性的菌株[12]。

1.3菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性測(cè)定

對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色并觀察其形態(tài)，并利用生理生化反應(yīng)管測(cè)定其糖類發(fā)酵等生理生化反應(yīng)特性[13]。

1.4菌株的16S rDNA基因克隆及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒上提取方法提取細(xì)菌總DNA。利用細(xì)菌的通用底物27F，5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ (M=A+C)和1 492R，5′-TACGGYTACCTTGT TACGACTT-3′

(Y=C+T)[14]克隆菌株的16S rDNA基因。PCR反應(yīng)體系：滅菌蒸餾水7.7 μL，10×PCR buffer(含15 mmol/L MgCl2)2 μL，2.5 mmol/L的dNTP 1.6 μL，2.5 μmol/L的引物各4 μL，DNA模板0.5 μL，5 U/μL Taq 酶 0.2 μL，加ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性5 min；94℃變性18 s，56℃退火15 s，72℃延伸78 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后檢測(cè)。

用B型小量DNA片段膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將膠回收產(chǎn)物與pMD18-T連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)40 min后，將菌液涂布含有氨芐青霉素的平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子送到華大基因有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。測(cè)定結(jié)果在NCBI的BLAST上進(jìn)行比對(duì)，利用Clustalx軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，通過(guò)Phylip-3.69軟件中最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[15]。

1.5菌株的生物學(xué)特性分析

研究溫度(20～50℃)、pH(3～10)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%～10%)、銅離子濃度(0～6 mmol/L)對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響(表1)。菌株在LB培養(yǎng)基中活化后，按2%接種量接種于不同條件的LB液體培養(yǎng)基中，基本培養(yǎng)條件為30℃，120 r/min培養(yǎng)12 h，測(cè)其OD600nm值，3次重復(fù)，取平均值。

表1菌株生物學(xué)特性的分析條件

1.6不同介體對(duì)菌株的芽孢漆酶脫色染料的影響

菌株芽孢漆酶液的制備方法參考文獻(xiàn)[16]，染料脫色體系包括0.1 mmol/L介體、染料、1 mg/mL芽孢漆酶液以及0.1 mol/L、pH=7.0檸檬酸-磷酸鹽緩沖液。所用的介體為乙酰丁香酮(AS)、2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)和丁香醛(SA)。所用的染料為雷馬素亮藍(lán)R(RBBR)、活性黑、靛紅和結(jié)晶紫，染料的類型、終濃度及最大吸收波長(zhǎng)見(jiàn)表2。并設(shè)不加介體的染料脫色對(duì)照組。40℃，160 r/min脫色2 h、4 h和6 h后分別取樣，14 000 r/min離心2 min后，用分光光度計(jì)測(cè)定各種染料最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值計(jì)算染料的脫色率，脫色率(%)=(A0-A)/A0×100%。式中，A0為初始染料吸光值，A為不同時(shí)間取樣時(shí)測(cè)的吸光值。

表2染料類型、終濃度及最大吸收波長(zhǎng)

Table 2 Type, final concentration and maximum absorption wavelength of four dyes

染料名稱Dye name染料類型Dye type終濃度/(mg/L)Final concentration最大吸收波長(zhǎng)/nmMaximum absorption wavelengthRBBR蒽醌100591活性黑 Reactive black偶氮40597靛紅 Isatin靛藍(lán)25610結(jié)晶紫 Crystal violet三苯甲烷5583

1.7數(shù)據(jù)處理

利用Excel計(jì)算3次重復(fù)數(shù)據(jù)的染料脫色率、脫色率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并利用SPSS軟件對(duì)不同介體對(duì)染料脫色率的影響進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2結(jié)果與分析

2.1具有漆酶活性菌株的篩選及分離

經(jīng)篩選對(duì)丁香醛連氮顯深紅色的編號(hào)為6BS的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2菌株6BS 的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性

菌株6BS在LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h，菌落乳白色，較小，圓形不透明，表面干燥，質(zhì)地粗糙，菌落邊緣呈現(xiàn)羽毛狀，革蘭氏染色呈藍(lán)紫色，短桿狀，為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。菌株6BS能利用甘露糖、蔗糖和葡萄糖作為碳源，不能利用阿拉伯糖、蜜二糖、木糖醇、山梨醇和枸櫞酸鹽，不產(chǎn)生精氨酸雙水解酶，菌株6BS屬于發(fā)酵型菌株。

2.3菌株6BS 的16S rDNA基因克隆及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

菌株6BS的16S rDNA基因經(jīng)克隆后測(cè)序共1 513 bp，在GenBank上提交序列獲得注冊(cè)號(hào)為MH127533。經(jīng)比對(duì)該菌株與多種芽孢桿菌的同源性達(dá)99%。結(jié)合菌株6BS形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rDNA同源性比對(duì)結(jié)果，鑒定該菌株為芽孢桿菌屬細(xì)菌，命名為Bacillussp. 6BS。由圖1可見(jiàn)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中菌株6BS與Bacillussubtilis關(guān)系最近。

圖1基于16S rDNA序列菌株6BS 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4菌株6BS 的生物學(xué)特性

菌株6BS的最適生長(zhǎng)溫度為37℃，在20～50℃均能生長(zhǎng)(圖2A)，最適生長(zhǎng)pH為8.0，在pH5.0～9.0長(zhǎng)勢(shì)很好(圖2B)，菌株6BS在含1%～2%NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛，能夠耐受5%的NaCl(圖2C)，菌株6BS對(duì)Cu2+的耐受性較強(qiáng)，小于0.4 mmol/L的Cu2+對(duì)菌株生長(zhǎng)無(wú)影響，其能耐受2 mmol/L的Cu2+(圖2D)。

圖2不同條件下菌株6BS 生長(zhǎng)的OD值

2.5不同介體對(duì)菌株6BS 芽孢漆酶脫色染料的反應(yīng)

不加介體的條件下脫色6 h，菌株6BS的芽孢漆酶對(duì)三苯甲烷類染料結(jié)晶紫(圖3A)和蒽醌類染料雷馬素亮藍(lán)R(圖3B)的脫色率較高，分別達(dá)到92.12%和70.64%。與不加介體的對(duì)照組相比，介體乙酰丁香酮能顯著提高芽孢漆酶對(duì)靛藍(lán)類染料靛紅，偶氮類染料活性黑和蒽醌類染料雷馬素亮藍(lán)R的脫色率，介體2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物能顯著提高芽孢漆酶對(duì)雷馬素亮藍(lán)R、靛紅和活性黑的脫色率，丁香醛能顯著提高芽孢漆酶對(duì)靛紅和活性黑的脫色率(圖3C、D)。乙酰丁香酮、2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物和丁香醛這3種介體對(duì)結(jié)晶紫脫色率無(wú)顯著影響，表明芽孢漆酶對(duì)結(jié)晶紫的脫色機(jī)制與其他3種染料不同。

注：結(jié)晶紫(A)、RBBR(B)、靛紅(C)和活性黑(D)的影響，不同小寫(xiě)字母表示不同介體的影響在0.05水平上差異顯著。

Note: A, Crystal violet; B, RBBR black; C, Isatin; D, Reactive. Different lowercase letters indicate significance of difference atP< 0.05 level.

圖3不同介體對(duì)菌株6BS芽孢漆酶脫色染料的反應(yīng)

Fig.3 Response of different mediators to dye decolorization by spore laccase of strain 6BS

3結(jié)論與討論

菌株6BS具有耐銅性，能耐受2 mmol/L的Cu2+，易于分離和篩選，與菌株4BS的耐銅特性相似[17]，均優(yōu)于菌株CLb[18]、菌株WD23[19]和菌株9BS[20]對(duì)Cu2+的耐受性。Cu2+是漆酶催化中心的輔助因子，對(duì)于漆酶表達(dá)后的折疊與組裝起重要作用，Cu2+能提高漆酶活性，是漆酶活性必須的輔助因子[17]。菌株6BS耐銅性對(duì)其應(yīng)用于廢水治理有重要意義。

本研究中，芽孢漆酶位于菌體的芽孢中，芽孢漆酶對(duì)染料的脫色是菌體和芽孢漆酶共同作用的結(jié)果。細(xì)菌表面具有各種活性基團(tuán)能夠吸附染料，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等組分也對(duì)染料有吸附能力[21]。芽孢漆酶可以通過(guò)O2催化多酚類物質(zhì)，因大多數(shù)染料分子中含有酚類結(jié)構(gòu)單元，故可被脫色[22]。但漆酶對(duì)一些染料的脫色效果較差，引入介體后，漆酶提高染料的脫色效率。漆酶氧化還原電勢(shì)低是限制漆酶活性的主要因素，而且也不能直接作用于高氧化還原電勢(shì)的底物。介體其實(shí)是一些分子量低、低氧化還原電勢(shì)的化合物，在漆酶的作用下易得失電子形成活性高且穩(wěn)定的中間體，并作用于底物，使其被氧化[23]。本研究中，菌株6BS的芽孢漆酶對(duì)三苯甲烷類染料結(jié)晶紫的脫色率較高，加入3種介體后，并無(wú)顯著提高芽孢漆酶對(duì)結(jié)晶紫的脫色率，表明芽孢漆酶對(duì)結(jié)晶紫的脫色主要是菌體的吸附作用，結(jié)晶紫的氧化還原電勢(shì)低，加入介體也未能增加其脫色效果。而加入介體乙酰丁香酮和2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物均能顯著提高菌株6BS的芽孢漆酶對(duì)靛紅、活性黑和雷馬素亮藍(lán)R的脫色率，加入介體丁香醛能顯著提高菌株6BS的芽孢漆酶對(duì)靛紅和活性黑的脫色率。介體共分為3類，有天然介體如乙酰丁香酮和丁香醛、合成介體如2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物和其他類介體。天然介體不僅來(lái)源易、花費(fèi)少且對(duì)環(huán)境友好[24]。在本研究中天然介體AS有顯著作用，是染料脫色中值得推薦的介體。

該研究結(jié)果表明：以Cu2+為篩選劑，以丁香醛連氮為底物，篩選出具有較高漆酶活性的菌株6BS，鑒定其為芽孢桿菌屬的細(xì)菌，故命名為Bacillussp. 6BS。菌株6BS能耐受5%NaCl和2 mmol/L Cu2+。天然介質(zhì)乙酰丁香酮、丁香醛，合成介質(zhì)2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物2種介體均能顯著提高菌株6BS的芽孢漆酶對(duì)靛紅和活性黑的脫色率。