乙肝性肝纖維化發(fā)病機理研究進展

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乙型肝炎病毒性肝炎是引起肝纖維化的重要因素，我國是乙型肝炎病毒感染的重災區(qū)。深入研究乙肝性肝炎、肝纖維化的發(fā)病機理，找到有效防治肝纖維化的方法或藥物，具有重要的社會價值和經(jīng)濟價值。本文就國內(nèi)外近年來對乙肝性肝纖維化的研究成果進行綜述，為開發(fā)有效防治乙肝性肝纖維化的新藥或治療方法提供一些可供參考的思路。

1 乙肝病毒感染與慢性肝炎、肝纖維化的發(fā)病率

我國的肝硬化多由乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染引起肝炎所致。估計全球大約有30%的人口與乙肝病毒 (HBV)接觸，其中有3.5億為HBV攜帶者，每年有100萬人口死于與HBV相關的疾病。乙肝患病率在0.1%～20%之間，西歐國家、美國、澳大利亞、新西蘭以及加拿大的患病率較低(0.1%～2%)，地中海國家、日本、中亞、拉丁南美洲以及中東次之((3%～5%) ，而東南亞、中國以及撒哈拉以南非洲的患病率最高(10%～20%)，疫苗的使用使其發(fā)病率大大降低，但HBV相關并發(fā)癥：腫瘤以及死亡人數(shù)卻仍在增加。慢性HBV感染的自然過程由病毒復制與機體免疫反應所決定，以下這些因素也可能與乙肝相關疾病的進程有關：性別、酒精消耗量以及與其它肝炎病毒共存現(xiàn)象等。

大約有40～50% 男性以及15%的女性會死于肝病相關的疾病，免疫活化可引起肝病進展，五年疾病進展的比例分別為：10～20%由慢性肝炎發(fā)展為肝硬化，20～30%由肝硬化代償期發(fā)展為失代償期，5～15%由肝硬化代償期發(fā)展為肝細胞肝癌。據(jù)此，其生存率分別為：代償性肝硬化5年生存率為85%；失代償期肝硬化的1年生存率為55～70%，5年生存率為15～35%。慢性HBV感染的結局決定于HBV復制停止時肝損傷的程度有關，當HBV復制控制后，其肝纖維化有可能反生逆轉[1]。慢性肝炎的肝纖維化發(fā)生率約為60%，其中25%～40%的肝纖維化患者最終發(fā)展為肝硬化[2]。

2 乙型肝炎發(fā)病機理

HBV感染引起肝纖維化的詳細機理還未得到系統(tǒng)闡明，但普遍認同的是HBV引起的肝損傷與機體的免疫應答密切相關。HBV是一種小分子折疊式DNA病毒，由于缺乏病毒聚合酶校正活性，在病毒復制過程中常發(fā)生核酸錯誤摻入所致的突變，導致HBV存在八種亞型，其中B亞型和C亞型分布在亞洲。在電鏡下可見三種病毒顆粒：傳染性病毒體和亞病毒顆粒。病毒膜含有三種病毒表面蛋白，分別為preS1 (或大)、preS2 (或中)和preS(或小)，這些蛋白與乙肝表面抗原(HBsAg)有關。幾乎所有的包膜病毒都含有來自宿主的蛋白，HBV顆粒也不例外。

當HBV病毒進入宿主體內(nèi)后首先引起先天性免疫應答，這種應答常開始于感染細胞迅速誘導干擾素(IFN)α/β生成，致使大量干擾素誘導基因(ISGs)表達，后者再發(fā)揮各種細胞內(nèi)抗病毒機制限制病毒產(chǎn)量和傳播，使病理變化過程縮小。

另一方面，獲得性免疫迅速啟動，首先是抗原-抗體反應。一般認為中和anti-HBs抗體在HBV感染恢復中發(fā)揮著重要作用——將傳染性封閉在感染的宿主體內(nèi)便于排出、破壞其病毒顆粒。這些抗體還可通過阻斷病毒與靶細胞的受體結合而阻止細胞發(fā)生重復感染。HBeAg是由于慢性感染患者體內(nèi)HBV特異性免疫太弱以至于從感染的肝細胞不能消除HBV病毒，但足以破壞HBV感染的肝細胞并引起慢性炎癥性肝病。

在HBV感染期，體液抗體與循環(huán)病毒顆粒的清除、防止病毒顆粒在宿主體內(nèi)傳播有關，而細胞免疫與消除感染細胞有關?？刂七M入體內(nèi)病毒的方式既有殺細胞的，也有非殺細胞的。非殺細胞作用一般通過釋放細胞因子或其它具有抗病毒作用的物質，沒必要損害感染細胞；相反，以殺細胞方式抑制病原則是通過殺死感染細胞而損傷組織。對病毒抗原的耐受、病毒抑制抗原加工或呈遞、感染免疫特殊位點、調節(jié)對細胞毒性介質的反應以及病毒發(fā)生變異等因素均有助于病毒感染持續(xù)化。

對HBV封膜抗原的抗體反應是T細胞依賴性過程，盡管外周血CD4+應答與病毒清除及急性肝炎有明顯關系，但CD4+細胞并不直接參與病毒的清除及組織損傷。HBVCD8+T細胞在病毒清除和肝臟損傷的病理中發(fā)揮了主要作用。

活化的CD4+T細胞各亞型分別產(chǎn)生不同的效應因子：如Th1細胞主要分泌IFNγ、淋巴毒素α(Lfα)和IL2。Th2 細胞主要分泌IL4、IL5、IL9、IL13、IL10、IL25和雙調蛋白(amphiregulin)。Th17 細胞的關鍵效應細胞因子包括IL17A、IL17F、IL21和IL22。Treg主要效應因子包括IL10、TGF-β和IL35。Tfh1通過分泌IFNγ促進IgG2a生成、Tfh2 分泌IL4有助于IgG1和IgE的生成，而Tfh10則通過分泌IL10促進IgA分泌[3]。

病毒感染促進多種前炎性細胞因子的分泌，引起CD8+T細胞增加，這些細胞因子包括：I型干擾素、IL-12家族成員、IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-21等，同時還包括IL-1家族成員IL-1、IL-18、IL-27及IL-33。盡管不同的病毒感染可引起不同的炎癥因子，但都會通過DCs和巨噬細胞產(chǎn)生大量的IL-12，IL-12與I型干擾素一起作用于CD8+T細胞的分化，IL-12誘導T細胞表達T-bet，高水平的T-bet刺激生命周期短暫的效應T細胞成體終末分化，而低水平的T-bet與記憶先驅T細胞的發(fā)育有關，這種T細胞可以繼續(xù)形成長壽命的記憶池。CD8+T細胞活化一方面產(chǎn)生大量的IFNγ抑制病毒復制，另一方面產(chǎn)生大量的細胞因子，發(fā)揮細胞毒性作用，對組織造成損傷[1,4,5,6]。HBV引起免疫反應的相關機制見圖1。

3 乙肝性肝纖維化發(fā)病機理

在免疫引起肝纖維化的過程中，病毒抗原蛋白以及免疫活化過程中產(chǎn)生的大量細胞因子特別是TGFβ、IL-10以及IL-18發(fā)揮了重要作用。

HBV引起的肝臟毒性與其諸多抗原蛋白密切相關。近期研究表明病毒蛋白HBeAg可以誘導Th2免疫反應，而HBcAg可誘導Th1免疫反應，當體內(nèi)Th2對HBeAg的反應強于Th1 對HBcAg的反應時，其結果將導致Th1的耗竭。Th1刺激巨噬細胞清除病毒顆粒，而Th2刺激B細胞產(chǎn)生免疫球蛋白粘附于病毒顆粒的表面并誘導調理素作用。每次肝炎伴隨的肝細胞再生與HBVDNA碎片表達病毒克隆肝炎Bx抗原(HBxAg)的增加密切相關，肝內(nèi)HBxAg與慢性肝病(CLD)的強度、進展相一致。另外，HBxAg還可阻斷Fas和TNFα介導的免疫性殺病毒作用，這不僅與HBxAg阻斷caspase活性有關，也與持續(xù)刺激肝臟保護作用通路密切相關，如：NF-κB、PI3K以及β-catenin，HBxAg也可通過刺激纖連蛋白(FN)的生成，并通過多種機制刺激TGFβ1的生成及活性。HBxAg通過改變多種MMPs的表達而表現(xiàn)出重塑細胞外基質 (ECM) 的作用，這樣，HBxAg通過減少免疫介導的感染肝細胞凋亡而促進感染慢性化，通過促進EMC重構使肝纖維化及肝硬化持續(xù)進展[1]。

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，在乙肝的發(fā)病過程中，TGFβ參與了多個免疫環(huán)節(jié)的調控，對疾病的進程起著非常重要的作用。近年的研究成果證明TGFβ在慢性肝病引起肝纖維化的過程中發(fā)揮了關鍵性的作用，活化的TGFβ可促使肝星狀細胞(HSCs)活化以及發(fā)生纖維化，TGFβ還可直接刺激α1、α2type(I) 前膠原、基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-1、TIMP-2、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1基因表達，而α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和結締組織因子(CTGF)的活化則是TGFβ依賴式的。在慢性肝損傷過程的不同階段TGFβ可能起著不同的作用，在早期，TGF-β促進肝細胞損害的同時，引起HSC轉型為肌成纖維細胞促進傷口愈合；在再生和肝細胞增殖階段，TGF-β具有組織體積限制性抑制細胞生長的作用，通過產(chǎn)生TRegs控制炎癥；在肝病持續(xù)及肝纖維化階段，大量的結疤形成傷口愈合反應對肝臟產(chǎn)生不良影響。在癌變前期，其抑制細胞生長的作用可以控制上皮細胞增殖阻止癌變發(fā)生，但同時由于TGF-β對炎癥的負調節(jié)可能抑制針對初生腫瘤的免疫反應；而在癌癥期，TGF-β抑制細胞生長的作用已經(jīng)消失，其另外的信號通路可能有助于腫瘤的進展及轉移，而且，TGF-β對內(nèi)皮細胞的促血管生成作用也可能有助于腫瘤的進展。TGFβ的促纖維化作用在許多動物模型中得到了證實，而針對TGF-β信號通路的治療策略在動物試驗模型方面取得巨大成功，但是，這些策略用于臨床的效果則微乎其微，導致這種結果的原因可能是TGF-β的功能具有生物多樣性的特點，同時也說明肝纖維化并非TGFβ單一因素異常所造成的結果[7]。

從圖1還可以看出，IL-18在乙肝引起的免疫反應中發(fā)揮了重要作用，一方面與IL-12一起誘導IFNγ生成，抑制病毒的復制，減輕感染；另一方面，IL-18還可誘導CD8+T細胞活化產(chǎn)生相應的細胞因子及產(chǎn)生細胞毒性作用，使感染細胞發(fā)生壞死。以前以為升高體內(nèi)IL-18可以有利于病毒的抑制，但采用外源性的IL-18用于治療乙肝引起的肝損傷并未獲得成功。與此相反，后來的研究發(fā)現(xiàn)，乙肝患者血中的IL-18濃度顯著高于正常人，且其濃度與肝病嚴重程度成正比[8]。有試驗[9]發(fā)現(xiàn)，在多個肝纖維化模型大鼠的肝臟組織中，其IL-18濃度顯著升高，而與此同時，IFNγ并未見升高，提示在慢性肝纖維化中，IL-18升高可能主要參與了誘導CD8+T活化使肝細胞壞死，其詳細機理還有待進一步研究。

圖1 乙肝病毒感染誘導肝纖維化發(fā)病機理示意圖

圖中英文簡寫的中文含義分別為：HBV(乙肝病毒)，HBcAg(乙肝核心抗原)，HBeAg(乙肝e抗原)，HBxAg(肝細胞再生與HBVDNA碎片表達病毒克隆肝炎Bx抗原)，Na?veCD4+(幼稚CD4+T細胞)，Na?veCD8+(幼稚CD8+T細胞)，iTreg(誘導性T調節(jié)細胞)，Tfh(濾泡輔助性T細胞)，M1、M2分別代表巨噬細胞兩個亞型，IL(白介素)，IFN(干擾素)，R(受體)，Th(輔助性T細胞)。HSC(肝星狀細胞)，TGF(轉化生長因子)。

另外一個值得注意的細胞因子為IL-10。多個實驗室[10,11]均發(fā)現(xiàn)多次注射ConA可引起IL-10 顯著升高。從圖1可見，IL-10在肝纖維化中的作用可能是通過誘導巨噬細胞M2c活化，產(chǎn)生TGFβ以及其它多種細胞外基質(ECM)，促進肝纖維化。另外，IL-10 通過信號傳遞至T細胞使其增殖減少、效應子如IFNγ生成減少。IL-10可通過減少巨噬細胞和DCs的抗原呈遞能力間接抑制T細胞應答，減少能夠產(chǎn)生放大效應反應的促炎癥細胞因子的表達[12]。

肝纖維化的特征是肝細胞減少、肝臟微小結構被破壞、肝臟肌纖維母細胞增殖以及細胞外基質過度堆積。終末期肝纖維化還可能包括肝臟解毒功能低下、肝細胞癌、門脈高壓、腎功能以及肺臟功能衰竭，并導致死亡率顯著增加。HBV引起肝纖維化的關鍵特征是纖維母細胞和肝星狀細胞的增殖與活化。處于靜息狀態(tài)的肝星狀細胞主要儲存維生素A，存在于內(nèi)皮下的狄氏間隙(spaceofDisse)。慢性肝損傷導致這些細胞活化、發(fā)生收縮、生成細胞外基質、分泌促炎性細胞因子和趨化因子，如轉化生長因子β(TGFβ)，這些細胞的活化被認為是肝纖維化的關鍵因素。肝星狀細胞活化依賴于庫否細胞(Kupffercells)、內(nèi)皮細胞、肝細胞以及血小板的信號傳遞。細胞外基質的堆積與降解長期存在，隨著肝纖維化的進程，該平衡向著有利于細胞外基質堆積傾斜。目前采用抗病毒治療能夠部分逆轉肝纖維化的結果說明：肝纖維過程一直處于動態(tài)之中，由于病毒的長期存在，新的肝損傷時時都在發(fā)生，使肝纖維化逐步加重[13]。

目前西醫(yī)防治乙肝所致的肝纖維化主要通過以下途徑：a) 治療原發(fā)病避免組織受損；b) 減輕炎癥或宿主反應以避免刺激星狀細胞活化；c) 保肝(hepatoprotection)以減輕肝臟損害，從而減輕刺激星狀細胞活化的信號傳遞；d) 直接下調星狀細胞活化；e) 抵消星狀細胞增殖、纖維化、收縮和/或促炎癥反應；f)刺激HSC凋亡；g) 增加疤痕組織降解，通過刺激細胞產(chǎn)生基質蛋白酶，或下調其抑制劑，或直接使用基質蛋白酶等[14]。

目前針對TGF-β信號通路的治療策略如：(1)序列特異性反義寡核苷酸抑制TGF-βmRNA表達，(2)同型選擇性中和抗體，可溶性TβRII碎片或合成的多肽干擾配體與內(nèi)源性受體結合成復合體，(3)過表達自然TGF-β信號抑制劑Smad7或細胞因子如IFN-γ誘導Smad7表達，(4)中和整合素的抗體干擾潛TGF-β活化，(5)低分子量的抑制劑拮抗TGF-β受體的細胞內(nèi)激酶的活性，這些策略在動物試驗模型方面取得巨大成功，但是，這些策略用于臨床的效果則微乎其微，導致這種結果的原因可能是TGF-β的功能具有生物多樣性的特點，同時也說明肝纖維化并非TGFβ單一因素異常所造成的結果[8]

4 小 結

目前，對于肝纖維化的機理研究主要集中于肝纖維化的形成方面，近期的臨床研究結果顯示抗HBV藥物對乙肝肝損傷有效，主要原因是其可以減少肝壞死和炎癥，對于肝纖維化逆轉的有效性有多高目前尚無準確的數(shù)據(jù)，但這些藥物多存在一些不良反應；針對肝纖維化其它環(huán)節(jié)的藥物療效還需進一步驗證。

近年來，隨著對肝纖維化逆轉機理的研究的深入，逐步注意到巨噬細胞在肝纖維化形成與降解中的重要作用，但要真正揭開肝纖維化形成與降解的全部機理還需進一步完成大量的工作。