山羊Th1/Th2細(xì)胞因子實(shí)時熒光定量檢測方法的建立

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細(xì)胞因子作為低分子量可溶性蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)固有免疫、細(xì)胞生長以及損傷組織修復(fù)等功能。在應(yīng)對各種病原體和許多疾病過程中，CD4+細(xì)胞調(diào)節(jié)宿主適當(dāng)?shù)募?xì)胞和體液免疫反應(yīng)[1]。CD4+T輔助細(xì)胞亞群Th1和Th2平衡在過敏和自身免疫性疾病中起重要作用。Thl細(xì)胞對細(xì)胞內(nèi)病原體(分枝桿菌和病毒)的免疫應(yīng)答過程特征性誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ、淋巴毒素(LT)和IL-2等細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞等，并促進(jìn)IgG2a的免疫球蛋白轉(zhuǎn)換[2]。Th2細(xì)胞對寄生蟲免疫反應(yīng)過程特征性誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13和IL-10等細(xì)胞因子[3]。這些細(xì)胞因子促進(jìn)肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的生長和分化以及IgG1和IgE的免疫球蛋白轉(zhuǎn)換[4]。一旦Th1或Th2反應(yīng)失調(diào)，Th細(xì)胞本身就有進(jìn)一步的極化的潛力。Th1細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ抑制Th2細(xì)胞的增殖，抑制IgE產(chǎn)生，并通過誘導(dǎo)T細(xì)胞上的IL-12受體β2鏈表達(dá)和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12來進(jìn)一步促進(jìn)Th1分化[5]。相比之下，Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4、IL-6和IL-10可以進(jìn)一步促進(jìn)Th2分化，抑制巨噬細(xì)胞抗原呈遞和IL-12的產(chǎn)生[6]。因此，Th1和Th2的反應(yīng)通常被認(rèn)為是相互排斥的。Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞主要功能分別為介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答、介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[7]。對Th1和Th2細(xì)胞因子進(jìn)行準(zhǔn)確定量研究，它將有助于疾病的預(yù)防和分子免疫調(diào)節(jié)[8]。

目前針對豬[9]、牛[10]、小鼠[11]、雞[12]細(xì)胞因子的實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)國內(nèi)已經(jīng)有人報道，然而針對山羊的Th1/Th2細(xì)胞因子熒光定量RT-PCR檢測方法的研究國內(nèi)尚無文獻(xiàn)報道。本文建立山羊Th1/Th2細(xì)胞因子SYBR GreenⅠReal-time PCR 檢測方法，為研究山羊痘感染后Th1/Th2細(xì)胞因子的動態(tài)變化規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試劑 外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；經(jīng)典總RNA抽提試劑盒等購自上海生工生物工程有限公司；2×Taq PCR MasterMix購自天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自于杭州愛思進(jìn)生命科學(xué)有限公司；ConA、PHA購自Invivogen公司；MLV Reverse Transcriptase、SYBR Green Real-time PCR Master Mix均購自Promega公司。

1.2菌株、載體 感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自全式金科技有限公司；pMD18-T載體購自大連寶生物公司。

1.3儀器 Nanodrop2000分光光度計、ABI Prismr 7500型熒光定量PCR儀均購自Thremo公司。

1.4引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank山羊Th1/Th2細(xì)胞因子基因序列，利用引物設(shè)計軟件PrimerExpress和Oligo7分別設(shè)計相應(yīng)的引物序列(見表1)，以上引物均由大連寶生物公司合成。

表1 Real-time PCR引物Tab.1 Primer for Real-time PCR

1.5cDNA樣品的制備 無菌采集健康山羊抗凝血20 mL，分離外周血單核細(xì)胞；刀豆素A(ConA)和植物血球凝集素(PHA)均可以在體外刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和分裂；本試驗(yàn)同時用ConA和PHA刺激12 h后加入Trizol收集樣品提取總RNA，提取步驟參考上海生工經(jīng)典總RNA試劑盒說明書，將樣品反轉(zhuǎn)錄后所得cDNA置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6基因克隆 利用山羊外周血提取獲得的RNA為模板，以山羊Th1/Th2細(xì)胞因子引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收純化后連接到pMD-18T載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，重組菌液涂布氨芐青霉素LB平板上培養(yǎng)12 h，挑取單菌落至含有氨芐青霉素的液體LB中，置于37 ℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)12 h后小量提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后送生工測序，將陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1.7標(biāo)準(zhǔn)品的制備 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品使用Nanodrop 2000分光光度計分別測量濃度，根據(jù)換算公式計算各樣品中重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)；然后對樣品分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，取不同稀釋度的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品模板。

1.8標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 通過對反應(yīng)的引物濃度(5 pmol/L、10 pmol/L、15 pmol/L和20 pmol/L、)、退火溫度(56 ℃～65 ℃)和循環(huán)數(shù)(30～40個)進(jìn)行優(yōu)化，最終確定優(yōu)化的反應(yīng)體系如下：10 pmol/L上、下游引物各1 μL、2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL、模板1 μL，去離子水補(bǔ)至20 μL。同時設(shè)陰性對照。山羊Th1/Th2細(xì)胞因子重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度系列稀釋，分別選取不同稀釋度的質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。系統(tǒng)將自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、擴(kuò)增效率以及溶解曲線。

1.9靈敏度實(shí)驗(yàn)以及重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做10倍梯度稀釋，共稀釋12個梯度，對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SYBR Green I 熒光定量PCR。用稀釋的樣品模板(同時設(shè)置陰性對照)進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，檢驗(yàn)該方法能檢測到的最低拷貝數(shù)。同時以各模板濃度梯度均進(jìn)行組內(nèi)及組間變異系數(shù)，分析試驗(yàn)的重復(fù)性。

1.10山羊外周血淋巴細(xì)胞因子mRNA的實(shí)時定量RT-PCR檢測 本實(shí)驗(yàn)利用山羊痘病毒AV41株、△N1L株和ConA分別刺激山羊外周血淋巴細(xì)胞，對IFN-γ和IL-4 mRNA熒光定量檢測，ConA刺激淋巴結(jié)細(xì)胞分泌Th1/Th2細(xì)胞因子為本實(shí)驗(yàn)陽性對照，同時設(shè)置陰性對照。采用絕對定量的方法，陰性對照數(shù)值為參照值。

1.11統(tǒng)計分析 運(yùn)用Graph Pad Prosm 7.0版，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1山羊Th1/Th2細(xì)胞因子基因片段擴(kuò)增 利用山羊外周血提取獲得的RNA為模板，擴(kuò)增目的片段與預(yù)期大小一致(圖1)。對構(gòu)建重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示，已經(jīng)成功構(gòu)建山羊Th1/Th2細(xì)胞因子質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。經(jīng)計算IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10基因質(zhì)?？截悢?shù)分別是：1.2×1010copies/μL、1.4×1010copies/μL、1.0×1010copies/μL、8.7×109copies/μL和1.1×1010copies/μL。

M:DL2000DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: IL-2 PCR產(chǎn)物；2:IFN-γPCR產(chǎn)物；3:IL-4 PCR產(chǎn)物；4:IL-6 PCR產(chǎn)物；5: IL-10 PCR產(chǎn)物

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及溶解曲線分析 山羊Th1/Th2細(xì)胞因子重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度系列稀釋，分別選取不同稀釋度的質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增(IL-2選取1.2×1010copies/μL-1.2×104copies/μL；IFN-γ選取1.4×1010copies/μL-1.4×104copies/μL；IL-4選取1.0×1010copies/μL-1.0×104copies/μL；IL-6選取8.7×109copies/μL-8.7×103copies/μL；IL-10選取1.1×1010copies/μL-1.1×104copies/μL)。結(jié)果表明IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系R2≥0.985以上(圖2)。

2.3特異性檢測 用建立的SYBR Green I 熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，只有1個特異性峰Tm值介于80.5 ℃～89.6 ℃之間，無引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)(圖3)。

2.4敏感性檢測結(jié)果 敏感性結(jié)果分析顯示，IL-2檢測體系中檢出下限為1.2×104copies/μL，IFN-γ檢測體系中檢出下限為1.4×104copies/μL，IL-4檢測體系中檢出下限為1.0×102copies/μL，IL-6檢測體系中檢出下限為8.7×102copies/μL，IL-10檢測體系中檢出下限為1.1×105copies/μL。除IL-10靈敏度較低外，其他檢測均可滿足本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求(圖4)。

2.5重復(fù)性檢測結(jié)果 將不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品Th1/Th2細(xì)胞因子質(zhì)粒進(jìn)行SYBR Green I 熒光定量PCR，每個稀釋度重復(fù)3次，用統(tǒng)計學(xué)軟件分析結(jié)果，表明建立的SYBR Green I 熒光定量PCR方法組間變異系數(shù)在0.52%～0.99%，組內(nèi)變異系數(shù)在0.58%～1.53%，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均在2%以內(nèi)重復(fù)性和穩(wěn)定性好。

圖2 IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-6 and IL-10 genes by SYBR Green Real-time PCR

圖3 SYBR Green I Real-time PCR的熔解曲線Fig.3 Melting curve of SYBR Green I Real-time PCR

圖4 SYBR Green I Real-time PCR敏感性分析Fig.4 Sensitivity analysis of the SYBR Green I Real-time PCR

表2 山羊Th1/Th2細(xì)胞因子熒光定量PCR檢測重復(fù)性試驗(yàn)Tab.2 Repeatability assay of Th1/Th2 cytokines florescence quantitativereal-time PCR

2.6山羊外周血淋巴細(xì)胞因子mRNA的實(shí)時定量RT-PCR檢測 ConA刺激外周血淋巴細(xì)胞IFN-γmRNA水平是對照組19.12倍，AV41株和△N1L株二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.215,P>0.05)；ConA刺激外周血淋巴細(xì)胞IL-4 mRNA水平是對照組3.38倍，但AV41株和△N1L株二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。綜上比較，AV41株和△N1L株山羊外周血淋巴細(xì)胞中IFN-γ和IL-4細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.333,P>0.05)，表明△N1L株基因缺失不影響機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫水平，為下一步山羊痘基因缺失疫苗構(gòu)建及其篩選奠定基礎(chǔ)。

a代表P≤0.001；b代表P≤0.05; NS代表差異無統(tǒng)計學(xué)意義

3 討 論

1986年Mosmann等[13]首次提出Th細(xì)胞分為Th1和Th2兩個功能亞群。IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的多效細(xì)胞因子，是唯一已知的II型干擾素。雖然最初發(fā)現(xiàn)其“干擾”病毒感染能力，現(xiàn)在其免疫調(diào)節(jié)功能迅速得到認(rèn)可[14]。IFN-γ在固有免疫和適應(yīng)性免疫都有許多重要的功能適應(yīng)性免疫力，其中一些包括上調(diào)粘附分子、激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞、T細(xì)胞激活和分化、上調(diào)主要組織可溶性復(fù)合物(MHC)分子以及誘導(dǎo)活性氧和活性氮中間[15]。另外，研究證實(shí)IFN-γ可以增強(qiáng)誘導(dǎo)I型IFN的抗病毒作用。IL-2也是Th1細(xì)胞因子之一，參與細(xì)胞免疫[16]。IL-2 作為人體免疫調(diào)節(jié)體系統(tǒng)中重要的淋巴因子,可刺激局部或全身的免疫應(yīng)答。

IL-4是Th2細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫。在免疫系統(tǒng)中IL-4，控制B細(xì)胞的發(fā)育、存活和成熟以及Th2細(xì)胞的增殖和分化[17]。IL-4通過誘導(dǎo)葡萄糖攝取和代謝部分地支持細(xì)胞增殖。活化的T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和骨髓來源的抑制細(xì)胞(MDSC)均可以產(chǎn)生IL-4。此外，IL-4也涉及到人類疾病包括哮喘、過敏和特應(yīng)性皮炎等。IL-6具有炎癥趨化及參與機(jī)體免疫過程，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[18]。IL-10為Th2細(xì)胞因子之一，作為免疫調(diào)節(jié)因子參與機(jī)體免疫反應(yīng)。IL-10 能夠通過抑制 IL-2 和IFN-γ等細(xì)胞因子起到免疫抑制作用[19]。

山羊Th1/Th2細(xì)胞因子熒光定量PCR方法采用染料法，并通過融解曲線排除非特異性干擾。該方法簡單迅速，可省去探針引物設(shè)計和合成，節(jié)約成本。熒光定量方法與普通PCR相比較可實(shí)時監(jiān)控整個PCR過程，該方法自動程度高，能比較直觀的進(jìn)行定量分析，同時也避免了交叉污染等問題。結(jié)果表明，建立的Real-time PCR定量方法組內(nèi)和組間變異系數(shù)均在2%以內(nèi)重復(fù)性和穩(wěn)定性好，Tm值介于80.5 ℃～89.6 ℃之間。正痘病毒編碼的N1蛋白同時具有抑制宿主細(xì)胞凋亡、NF-κB和IRF-3信號通路的能力，在病毒突破宿主免疫防御過程中發(fā)揮重要作用。本研究前期構(gòu)建N1蛋白缺失重組山羊痘病毒，通過體外感染外周血淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，比較重組山羊痘病毒△N1L和山羊痘AV41株產(chǎn)生Th1/Th2細(xì)胞因子，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究構(gòu)建的熒光定量檢測方法為下一步山羊痘基因工程疫苗的篩選奠定基礎(chǔ)。

利益沖突：無