人結(jié)膜吸吮線蟲病2例報(bào)告及Cox1基因分析

， ， ，，安春

吸吮線蟲病(Thelaziosis)是由吸吮線蟲引起的一種人獸共患線蟲病。狗、貓、牛等家畜和野生哺乳動(dòng)物為其適宜宿主，人體也可偶而被感染[1]。吸吮線蟲種類繁多，目前已經(jīng)確定的至少有30多種。以往報(bào)道能人體引起人體感染的吸吮線蟲有兩種，即結(jié)膜吸吮線蟲(T.callipaeda)和加里福尼亞吸吮線蟲(T.californiensis)。2018年，Bradbury在美國發(fā)現(xiàn)了可引起人體感染的第3種吸吮線蟲，即大口吸吮線蟲(T.gulosa)，也稱牛眼蟲(the cattle eyeworm)[2]。吸吮線蟲呈世界性散在分布。中國、日本、印度、緬甸、韓國、中國臺(tái)灣、泰國、印度尼西亞、俄羅斯，意大利和法國等均有人體病例報(bào)道。不同種吸吮線蟲不僅有形態(tài)差異，而且地域分布也有不同[3-4]。結(jié)膜吸吮線蟲主要分布于中國、韓國及印度等東南亞國家和地區(qū)[5-7]，故又被稱為東方眼蟲。此外，在意大利、羅馬尼亞及英國等歐洲也有結(jié)膜吸吮線蟲病例報(bào)道[8-10]。加里福尼亞吸吮線蟲見于美國西部[11]，大口吸吮線蟲僅發(fā)現(xiàn)于北美[2]。中國是吸吮線蟲病報(bào)道最多的國家，自1917年首先在北京和福建報(bào)道結(jié)膜吸吮線蟲人體病例以來，各地陸續(xù)報(bào)道，至2016年底，報(bào)告病例數(shù)已達(dá)626例[12]。此前的病例報(bào)告主要依據(jù)形態(tài)學(xué)特征或臨床癥狀進(jìn)行診斷。本課題組曾報(bào)道了用Cox1基因鑒定的人結(jié)膜吸吮線蟲病[5,13-14]。本文對分別新發(fā)現(xiàn)于遼寧和山東的2例感染者分離到的蟲體進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、Cox1基因鑒定、測序及序列分析，對兩地分離株系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行了分析探討。

1 材料和方法

1.1蟲體來源 蟲體1來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科門診就診患者，蟲體2源于山東省寄生蟲病研究所就診患者。兩條蟲體均由眼科醫(yī)生取出，生理鹽水保存。并分別經(jīng)患者知情，并通過所在醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行蟲體鑒定。

1.2形態(tài)學(xué)鑒定 將蟲體置于含生理鹽水的平皿中，用解剖顯微鏡觀察蟲體的大體形態(tài)。再行鹽酸卡紅染色，顯微鏡下觀察微細(xì)結(jié)構(gòu)。之后將蟲體于75%乙醇溶液4 ℃保存。

1.3 基因鑒定

1.3.1DNA提取 從保存液中取出蟲體，于勻漿器中研磨，然后用SDS/蛋白激酶K消化，常規(guī)酚氯仿法提取基因組DNA，加入TE緩沖液，-20 ℃保存。

1.3.2PCR擴(kuò)增 查閱文獻(xiàn)，上游引物：NTF：5′-TGATTGGTGGTTTTGGTAA-3′，下游引物：NTR：5′-ATAAGTACGAGTATCAATATC-3′。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：DNA 模板2 μL，Premix25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，并加水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。滅菌ddH2O作空白對照。

1.3.3樣品測序 取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳確定為目的基因，余45 μL產(chǎn)物送北京華大公司進(jìn)行基因測序。

1.3.4DNA序列比對 采用Contig Express軟件對雙向測序獲得的兩對序列進(jìn)行拼接，然后經(jīng)DNAStar軟件進(jìn)行人工校正，在NCBI上進(jìn)行同源性比較；使用MEGA7軟件與獲得目標(biāo)序列進(jìn)行完全比對,以鄰接法(neighbor-joining method,NJ)繪制種系發(fā)育樹，Bootstrap置信值重復(fù)抽樣1000次。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 顯微鏡觀察蟲體外觀細(xì)長呈線狀、乳白色、半透明，成蟲頭端及尾端圓鈍，蟲體表面具有明顯的鋸齒狀橫紋，前端有一典型的六角形梯狀口腔(圖1),雌蟲尾端較鈍，雄蟲尾端較尖且由泄殖腔內(nèi)伸出向腹面彎曲的長短交合刺各1根。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，對比和參照文獻(xiàn)，認(rèn)定蟲體1(11 mm×0.4 mm)為結(jié)膜吸吮線蟲雌蟲、蟲體2(12 mm×0.5 mm)為結(jié)膜吸吮線蟲雄蟲。

圖1 蟲體的頭部，顯示六角形口囊(鹽酸卡紅染色)(40×)Fig.1 Head and the hexagonal mouth stained by hydrochloric acid-armine(40×)

圖2 瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis

2.2基因鑒定結(jié)果 2例蟲體經(jīng)Cox1基因擴(kuò)增均得到689 bp目的片段(圖2)，雙向測通，BLAST同源性分析的結(jié)果顯示與結(jié)膜吸吮線蟲線粒體全基因組的一致性 (Similarity Index)均為99%。DNAStar軟件分析2例標(biāo)本一致性為98.3%，8個(gè)堿基突變位點(diǎn)(G/A位于221、236、467、473、608；C/T位于225、401、539)。11個(gè)不同地理分布株一致性為98%～100%。

2.3Cox1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Cox1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析如圖3所示，比較結(jié)果表明，遼寧人源結(jié)膜吸吮線蟲與意大利犬源(AM042555.1)屬于同一分支,與歐洲株同源,且2例標(biāo)本一致性為99.1%，6個(gè)堿基突變位點(diǎn)(G/T位于8；G/A位于311、468；C/T位于39、47、401)；山東人源結(jié)膜吸吮線蟲與羅馬尼亞犬源(KP087796.1)、斯洛伐克犬源(KY476400.1)、匈牙利貓?jiān)?KX372681.1)及塞爾維亞貓?jiān)?KJ433983.1)屬于同一大分支，亦與歐洲株同源,一致性為99.6%,3個(gè)堿基突變位點(diǎn)(G/T位于8；G/A位于221、257)。

圖3 Cox1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Cox1 gene

3 討 論

采用DNA序列分析仍然是鑒定結(jié)膜吸吮線蟲蟲種、亞種、株和遺傳變異最可靠的方法[15]。線粒體基因由于其母系遺傳、DNA進(jìn)化速率快且不發(fā)生重組，可作為分子標(biāo)記用于生物分子種群遺傳學(xué)的研究[16-17]。在寄生蟲的分類鑒定和群體遺傳方面，Cox1基因的插入和缺失較少，長度及進(jìn)化速度適中，常被用作物種種群遺傳和系統(tǒng)進(jìn)化的研究[18]。但目前結(jié)膜吸吮線蟲的線粒體基因組信息報(bào)道較少，僅見Liu[19]等報(bào)道的中國廣東省犬源結(jié)膜吸吮線蟲的線粒體基因組特征：全長13 668 bp,富含AT堿基(74.6%),包含12個(gè)蛋白編碼基因、22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因、2個(gè)核糖體RNA基因和1個(gè)非編碼區(qū)，并缺乏1個(gè)atp8基因。首次闡明我國犬源結(jié)膜吸吮線蟲線粒體基因組，該基因組為研究寄生蟲的流行病學(xué)、生態(tài)學(xué)、群體遺傳學(xué)提供了新的遺傳標(biāo)記。Otranto[20]等采集自中國、韓國、意大利和德國的動(dòng)物源結(jié)膜吸吮線蟲，對Cox1基因進(jìn)行測序和基因突變掃描，發(fā)現(xiàn)50個(gè)成蟲標(biāo)本有8種不同的基因變異序列。在已經(jīng)發(fā)表的GenBank數(shù)據(jù)庫中，有關(guān)結(jié)膜吸吮線蟲Cox1基因序列僅有15條，按地區(qū)來源選取9條序列。

迄今的流行病學(xué)資料表明，結(jié)膜吸吮線蟲主要分布于中國、韓國及印度等東南亞國家和地區(qū)[5-7],加里福尼亞吸吮線蟲見于美國西部[11]，大口吸吮線蟲僅發(fā)現(xiàn)于北美[2]。中國是吸吮線蟲病高發(fā)的地區(qū)，迄今見文獻(xiàn)報(bào)道的600多宗人體病例基本是依據(jù)蟲體的形態(tài)學(xué)或臨床表現(xiàn)等診斷為結(jié)膜吸吮線蟲,尚缺乏可靠的分子水平的證據(jù),也無法區(qū)分不同種、株間由于受自然、地理等環(huán)境因素長期影響產(chǎn)生的遺傳分化程度。中國境內(nèi)是否存在其它吸吮線蟲蟲種感染人體或動(dòng)物有待于進(jìn)一步證明。本課題組曾報(bào)道了用Cox1基因鑒定的人源結(jié)膜吸吮線蟲[5,13-14]。本文對新分別發(fā)現(xiàn)于遼寧和山東的2例感染者分離到的蟲體進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，在初步證明是吸吮線蟲的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了Cox1基因鑒定、測序及序列分析，從基因水平證明兩地人源蟲體均屬于結(jié)膜吸吮線蟲。將測得的遼寧和山東兩省人源結(jié)膜吸吮線蟲Cox1基因序列進(jìn)行比對、構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析結(jié)果顯示遼寧結(jié)膜吸吮線蟲與意大利犬源(AM042555.1)屬于同一分支，山東結(jié)膜吸吮線蟲與羅馬尼亞犬源(KP087796.1)、斯洛伐克犬源(KY476400.1)、匈牙利貓?jiān)?KX372681.1)及塞爾維亞貓?jiān)?KJ433983.1)屬于同一大分支，說明二者均與歐洲株同源。本研究證明了我國人體感染的結(jié)膜吸吮線蟲與我國犬感染的蟲種以及歐洲源蟲體基因的同源性，且蟲株之間未見明顯遺傳變異現(xiàn)象(98%～100%)。

本研究通過檢測獲得遼寧和山東兩地人感染的結(jié)膜吸吮線蟲Cox1基因，驗(yàn)證了Cox1基因可以作為結(jié)膜吸吮線蟲的分子診斷標(biāo)記，進(jìn)一步豐富了有關(guān)結(jié)膜吸吮線蟲基因序列的基礎(chǔ)資料。但由于目前結(jié)膜吸吮線蟲基因信息相對匱乏，構(gòu)建發(fā)育樹的參考序列有限，使得我國結(jié)膜吸吮線蟲的分子分類鑒定和群體遺傳變異研究方面尚需更多工作要做。

利益沖突：無