肝癌介入栓塞用鹽酸吉西他濱溫敏凝膠的制備與質(zhì)量評價*

潘倩雯，李力，李涵，趙彥兵，劉宏

(1.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，武漢 430070；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065；3.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430075；4.國家納米藥物工程技術(shù)研究中心，武漢 430075)

肝細胞癌(hepatocellular carcinomas，HCC)是我國死亡率較高的惡性腫瘤之一，因其發(fā)病隱匿，確診時多處中晚期。因肝腫瘤體積過大、肝儲備功能不佳等原因，大部分患者無法通過肝切除及肝移植來治療，經(jīng)導(dǎo)管動脈化學(xué)栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)已經(jīng)成為此類無法行手術(shù)治療肝癌患者的一線治療方案[1-2]。吉西他濱(gemcitabine)是核糖核酸還原酶抑制劑，主要作用于DNA合成期腫瘤細胞，使其DNA合成停止，殺滅腫瘤細胞。研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度范圍內(nèi)的吉西他濱可顯著促進腫瘤細胞凋亡[3]，臨床常采用的治療方法是鹽酸吉西他濱靜脈注射，但全身用藥不良反應(yīng)較大且靶向性差，因此在肝癌細胞附近不易達到較高治療濃度。N-異丙基丙稀酰胺-co-甲基丙烯酸丁酯(N-isopropyl-acrylamide-co-butyl methylacrylate，PIB)是一種溫敏凝膠，在常溫下為液體，生理溫度時可發(fā)生膠凝的永久性栓塞。碘海醇(iohexol)為臨床常用造影劑。含碘海醇的鹽酸吉西他濱溫敏凝膠是一種具有化療、栓塞、造影作用的新型抗腫瘤栓塞劑，不僅能有效阻斷肝癌細胞血供，減少TACE單用復(fù)發(fā)率，同時可使吉西他濱在肝組織達到局部高濃度，提高化療效果，避免全身大劑量用藥，降低吉西他濱不良反應(yīng)。為保證制劑質(zhì)量，筆者在本實驗對鹽酸吉西他濱溫敏凝膠的黏度、復(fù)合模量及膠凝溫度進行評價，測定鹽酸吉西他濱溫敏凝膠的體外釋放度；還建立了同時測定鹽酸吉西他濱溫敏凝膠中鹽酸吉西他濱和碘海醇含量的測定方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 電子分析天平( BS323S，德國Sartorius公司，感量：0.001 g)；多頭磁力加熱攪拌器(HJ-6，常州國華電器有限公司)；Malvern高級旋轉(zhuǎn)流變儀(Kinexus Pro KNX2100，上海百思吉儀器有限公司)；高效液相色譜儀(DGU-20A5R，日本島津公司)；pH計(HS-25，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(UV-1750，日本島津公司)；Welchrom C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；高速離心機(TG16，長沙英泰儀器有限公司)；蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；恒溫磁力攪拌器(85-2型，上海司樂儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-50DS，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 鹽酸吉西他濱原料藥(上海阿達瑪斯試劑有限公司，批號：P07052-201506，含量：99%)；PIB(國家納米藥物工程技術(shù)研究中心饋贈，批號：20170527)；鹽酸吉西他濱溫敏凝膠(自制，批號：20170607，20170609，20170611)；碘海醇(浙江海昌藥業(yè)有限公司，批號：C001504003)；乙酸銨[色譜級，阿拉丁試劑(上海)有限公司，含量≥99.0%，批號：A112057]；氨丁三醇(深圳市優(yōu)普惠藥品有限公司，批號：8386I036，)；乙二胺四乙酸鈣鈉鹽水合物(上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司，含量≥98.0%，批號：K562008)；乙-腈(色譜純)。磷酸二氫鈉(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：F20111123)；磷酸氫二鈉(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20130802)。

2 方法與結(jié)果

2.1鹽酸吉西他濱溫敏凝膠的制備 精密稱取碘海醇、穩(wěn)定劑(氨丁三醇、EDTA鈣鈉鹽水合物)，置于干燥潔凈燒杯，待其溶解后置于100 mL量瓶，加適量去離子水搖勻并定容。將配置好的碘海醇溶液倒入干燥潔凈燒杯，精密稱取處方量PIB、吉西他濱倒入燒杯，放入攪拌子，于冰浴條件下多頭磁力攪拌器上以恒定轉(zhuǎn)速攪拌24 h，直至得到淡藍色均勻溶液，于4 ℃冰箱中靜置60 min即得。

2.2鹽酸吉西他濱溫敏凝膠黏度的測定 取3批樣品，分別采用旋轉(zhuǎn)流變儀測定溫敏凝膠黏度，設(shè)定流變儀底板溫度為25 ℃，剪切速率300 s-1，記錄黏度數(shù)據(jù)。結(jié)果為(31.06±1.72) mPa·s-1(n=3)。在常溫狀態(tài)下，溫敏凝膠應(yīng)為可自由流動液體，本制劑將溫敏凝膠黏度期望值設(shè)定為20～35 mPa·s-1。當(dāng)黏度值<20 mPa·s-1，溫敏凝膠雖可膠凝，但易被血流沖刷；當(dāng)黏度值大于35 mPa·s-1時，溫敏凝膠流動性顯著變差，在介入栓塞過程中，不易經(jīng)導(dǎo)管導(dǎo)入腫瘤供血動脈栓塞。故本制劑黏度值符合要求。

2.3鹽酸吉西他濱溫敏凝膠復(fù)合模量及膠凝溫度的測定 取3批樣品，分別采用旋轉(zhuǎn)流變儀測定溫敏凝膠的膠凝溫度及37 ℃時溫敏凝膠復(fù)合模量，設(shè)定流變儀底板溫度變化范圍為25～40 ℃，記錄數(shù)據(jù)。測得溫敏凝膠膠凝溫度為(34.30±0.01) ℃，溫敏凝膠在37 ℃下復(fù)合模量為(120.20±9.15)Pa。對于介入栓塞用制劑，應(yīng)在常溫下保持較好的流動性，導(dǎo)入靶點后應(yīng)能在原位膠凝，并具有一定強度，防止血流沖刷。本制劑膠凝溫度略低于人體體溫而高于室溫，并且具有較高的復(fù)合模量，符合介入制劑的要求。

2.4鹽酸吉西他濱溫敏凝膠中鹽酸吉西他濱和碘海醇的含量測定

2.4.1色譜條件 色譜柱：Welchrom-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：醋酸銨緩沖液(取醋酸銨3.08 g溶于500 mL水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.5±0.1，然后加水至1000 mL，攪勻即得)：乙腈=(97.5：2.5)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；理論板數(shù)分別按吉西他濱和碘海醇計算，均不低于4000。

2.4.2溶液的制備 ①鹽酸吉西他濱溫敏凝膠供試品溶液的制備。精密量取“2.1”項鹽酸吉西他濱溫敏凝膠適量(相當(dāng)于含鹽酸吉西他濱0.2 g，碘海醇8.87 g)，置超濾管中，高速離心，濾液置于4 ℃冰箱內(nèi)保存。

精密量取濾液適量于100 mL量瓶，加去離子水至刻度，搖勻，制成每毫升約含鹽酸吉西他濱0.2 mg、碘海醇以碘計1.37 mg的溶液，用孔徑0.22 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

②對照品溶液的制備。精密稱取鹽酸吉西他濱0.1000 g、碘海醇4.3600 g、穩(wěn)定劑適量于同一50 mL量瓶，加純化水溶解并稀釋至刻度搖勻，制成鹽酸吉西他濱、碘海醇濃度分別為2和87.2 mg·mL-1(碘海醇濃度以碘計為13.71 mgI·mL-1)的溶液，并以此作為對照品儲備液。精密吸取上述儲備液1 mL于10 mL量瓶，加去離子水稀釋至刻度并搖勻，用孔徑0.22 μm濾膜濾過即得混合對照品溶液。

精密稱取鹽酸吉西他濱0.100 0 g適量于50 mL量瓶，加純化水并稀釋至刻度定容，制成2 mg·mL-1鹽酸吉西他濱對照品溶液。

精密稱取鹽酸吉西他濱4.360 0 g適量于50 mL量瓶，加純化水并稀釋至刻度定容，制成13.71 mgI·mL-1碘海醇對照品溶液。

③空白凝膠溶液的制備。按“2.4.2”①項制備不含藥及碘海醇的空白凝膠，置于超濾管中，離心后取濾液，稀釋后經(jīng)孔徑0.22 μm濾膜濾過即得空白凝膠溶液。

2.4.3專屬性實驗 分別取按“2.4.2”項制備的鹽酸吉西他濱、碘海醇對照品溶液、鹽酸吉西他濱溫敏凝膠供試品溶液及空白凝膠溶液各20 μL，按“2.4.1”項色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，見圖1。鹽酸吉西他濱出峰時間約11.5 min，碘海醇因其異構(gòu)體結(jié)構(gòu)，出雙峰，分別約在18.5和20 min處出峰?？瞻纵o料及溶劑對鹽酸吉西他濱和碘海醇的含量測定無干擾。

2.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取“2.4.2”②項混合對照品儲備液50，100，200，500，1000，2000 μL，置于10 mL量瓶，加入去離子水稀釋至刻度，搖勻。分別得到鹽酸吉西他濱濃度為5，10，20，50，100，200 μg·mL-1，碘海醇以碘計濃度為34.29，68.57，137.14，342.86，685.71，1371.43 μgI·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上述溶液過孔徑0.22 μm濾膜后分別精密吸取20 μL，按照“2.3.1”項色譜條件依次進樣分析，測定峰面積(A)。每個濃度測定3次，取峰面積平均值。以濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以A為縱坐標(biāo)，進行線性回歸。得回歸方程。鹽酸吉西他濱：A=30 295C+2 330.6，r=0.999 9；碘海醇：A=11 879C-29 613，r=0.999 6。結(jié)果表明，鹽酸吉西他濱在5～200 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，碘海醇在34～1372 μgI·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

A.空白凝膠溶液；B.鹽酸吉西他濱；C.碘海醇；D.鹽酸吉西他濱溫敏凝膠；1.吉西他濱；2-3.碘海醇

圖14種溶液的HPLC圖

A.blank gel solution；B.gemcitabine hydrochloride；C.iohexol；D.gemcitabine hydrochloride thermosensitive hydrogel；1.GEM；2-3.IOH

Fig.1HPLCchromatogramoffourkindsofsolution

2.4.5重復(fù)性實驗 取同一批(批號：20170607)鹽酸吉西他濱溫敏凝膠樣品6份，按“2.2.3”項制備樣品溶液，測定峰面積，計算得到鹽酸吉西他濱RSD為0.02%(n=6)；碘海醇RSD為0.27%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6精密度實驗 按“2.4.2”②項配制以鹽酸吉西他濱計10，50，100 μg·mL-1；以碘海醇計68.57，342.86，685.71 μgI·mL-13種濃度混合對照品溶液，精密吸取20 μL，每個樣品測定3次，于同一天3個時間段分別測定一次，測定其日間精密度；每天在同一時間段進樣，分別連續(xù)測定3 d，測定其日間精密度。日內(nèi)精密度：低中高濃度鹽酸吉西他濱日內(nèi)RSD分別為0.12%，0.05%，0.04%(n=3)；碘海醇日內(nèi)RSD分別為0.25%，0.32%，0.51%。日間精密度：低中高濃度鹽酸吉西他濱日間RSD為0.22%，0.05%，0.09%(n=3)；碘海醇日間RSD分別為0.24%，0.66%，0.61%(n=3)。表明該方法下日內(nèi)及日間精密度均良好。

2.4.7加樣回收率實驗 配制80%，100%，120%溶液：精密吸取按“2.3.2”項制備的混合對照品溶液2.5 mL，置10 mL量瓶，分別加入供試品溶液1.5，2.5，3.5 mL，加入去離子水稀釋定容至刻度，搖勻。每個濃度配制3份[4]。 精密吸取上述過濾后溶液20 μL注入色譜儀，按“2.4.1”項色譜條件依次進行分析，記錄色譜圖，計算回收率。結(jié)果低、中、高濃度鹽酸吉西他濱的加樣回收率分別為(100.0±0.8)%，(101.8±0.7)%，(99.80±2.3)%，RSD分別為0.63%，0.88%，0.93%。平均回收率100.53%，RSD=0.95(n=9)；低、中、高濃度碘海醇加樣回收率分別為(99.9±0.3)%，(99.5±0.7)%，(100.1±0.9)%，RSD分別為0.25%，0.31%，0.56%。平均回收率99.83%，RSD=0.77%(n=9)。

2.4.8樣品含量測定 精密吸取3批溫敏凝膠樣品各6份(批號：20170607，20170609，20170611)，每份1 mL。按“2.4.2”項制備供試品溶液，濾過后分別進樣20 μL，記錄峰面積，根據(jù)回歸方程計算樣品中鹽酸吉西他濱及碘海醇的含量。結(jié)果見表1。鹽酸吉西他濱平均含量為100.4%，RSD為0.73%；碘海醇平均含量為99.97%，RSD為0.31%。3批樣品含量測定結(jié)果均在95%～105%，符合規(guī)定。

表1鹽酸吉西他濱和碘海醇含量測定結(jié)果

Tab.1Resultsofcontentdeterminationofgemcitabinehydrochlorideandiodohexanol

%

2.5鹽酸吉西他濱溫敏凝膠體外釋放度測定 采用蠕動泵進行體外釋放實驗，整個實驗采用自制裝備，本實驗中用到的釋放池為專門訂制的三開口池。上端開口配玻璃塞，用于加樣，加樣后用玻璃塞封閉。釋放池兩端開口，左右對稱，為直徑0.5 cm、長約1 cm玻璃管，用于橡膠管與管道之間的連接。釋放池一端連接蠕動泵，一端連接燒杯接收釋放液，同時將釋放池置于37 ℃恒溫水浴鍋；蠕動泵另一端連接同樣置于37 ℃恒溫水浴鍋中PBS緩沖液，將泵轉(zhuǎn)速設(shè)置為10 r·min-1(8.67 mL·h-1)，待釋放池中溫敏凝膠相轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w時，啟動蠕動泵，等緩沖液流入釋放池，開始計時[5]。分別在1，2，4，6，8，10，12，24，48 h定時取樣，用孔徑0.22 μm濾膜濾過后取續(xù)濾液按“2.3.1”項色譜條件進柱分析，測定峰面積，并根據(jù)回歸方程計算含量，從而計算藥物累積釋放率。并采用零級動力學(xué)方程、一級動力學(xué)方程、Higuchi方程、Ritger-Peppas 方程、Neibergull方程對體外釋放結(jié)果進行擬合。釋放曲線見圖2，擬合結(jié)果見表2。由圖2和表2可知，鹽酸吉西他濱在12 h處累積釋藥可達90.98%，從擬合方程R2值可知，釋放曲線與Ritger-Peppas 方程擬合度最高，特征指數(shù)n=0.53，介于0.45～0.89，說明鹽酸吉西他濱溫敏凝膠中藥物的釋放為non-Fick釋放，即擴散與骨架溶蝕共同控制釋放過程。

圖2 鹽酸吉西他濱溫敏凝膠累積釋藥曲線

Fig.2Curveofcumulativedrugreleaseofgemcitabinehydrochloridethermosensitivehydrogel

表2鹽酸吉西他濱溫敏凝膠體外釋藥曲線擬合結(jié)果

Tab.2Fittingequationofinvitroreleaseofgemcitabinehydrochloridethermosensitivehydrogel

模型擬合方程R2零級動力學(xué)方程Q=8.642 6t+4.750 40.971 9一級動力學(xué)方程Ln(100-Q)=0.235lnt+5.050 70.921 6Higuchi方程Q=38.532t1/2-41.480.949 7Ritger-Peppas 方程lnQ=1.1558lnt+1.733 50.990 6Neibergull方程(100-Q)1/2=0.679 7t+10.8630.960 1

3 討論

介入栓塞劑與抗腫瘤藥聯(lián)合使用可顯著提高介入治療的效果，核糖核酸還原酶抑制劑鹽酸吉西他濱主要代謝物在細胞內(nèi)可以摻入DNA，主要作用于腫瘤細胞的G1/S期，使腫瘤細胞內(nèi)脫氧核苷三磷酸酯減少。其毒性主要是骨髓抑制，其中對中性粒細胞和血小板影響較常見。與介入栓塞劑合用后，鹽酸吉西他濱使用量可大幅減少，而腫瘤局部濃度可大幅提高。

常用于考察溫敏凝膠制劑體外釋放度的方法有透析袋法、無膜溶出法。筆者在本實驗曾采用透析袋法對鹽酸吉西他濱溫敏凝膠的體外釋放做過考察，但累積釋放率不理想。考慮PIB為高分子材料，可能對透析袋的空隙造成一定堵塞，同時，經(jīng)過一定時間振蕩，透析袋內(nèi)外濃度差可能達到平衡，這些都可能使鹽酸吉西他濱不能釋放完全。此外，鹽酸吉西他濱溫敏凝膠為肝癌動脈介入栓塞用制劑，故選用蠕動泵法模擬體內(nèi)血流對凝膠沖刷的場景，相較于透析袋可更真實反映釋放過程，同時可避免透析袋的上述缺陷。對于釋放介質(zhì)的選擇，本實驗則參考腫瘤微環(huán)境，選擇了pH值6.8的PBS緩沖液作為釋放介質(zhì)。

對溫敏凝膠中鹽酸吉西他濱和碘海醇的含量測定采用HPLC法，而具有溫度敏感性的化合物在作為藥物載體時，對其中藥物成分進行檢測時通常會遇到各種困擾。PIB凝膠作為一種溫度敏感性高分子聚合物[6]，通過粒徑檢測儀檢測，其平均粒徑150～300 nm，若直接進柱進行液相分析，極有可能造成色譜柱堵塞，損壞儀器；同時因為鹽酸吉西他濱溫敏凝膠在常溫下為液態(tài)，到達膠凝溫度時會發(fā)生相變轉(zhuǎn)化為半固體狀態(tài)，在進入色譜柱后發(fā)生相變也極易堵塞色譜柱；因此在進柱前必須對樣品進行處理，防止PIB對色譜柱產(chǎn)生影響。常用的有高溫法、透析袋法，以及超濾法。其中高溫法可能會對GEM產(chǎn)生影響；而透析袋法雖操作簡單，但耗時較長。因此本研究采用超濾法，選用截留分子量為30 000的超濾管，將鹽酸吉西他濱溫敏凝膠、空白凝膠放入超濾管中，在5000 r·min-1條件下離心10 min后取其濾液，稀釋到所需倍數(shù)然后進柱分析。該方法既解決了PIB凝膠對色譜柱的影響，又提高了實驗效率，同時也為各種凝膠類藥物的進柱前處理提供了一種新思路。