黃芩及其提取物中黃芩素成分分析標準物質(zhì)的研制*

邢逞，張麗，馬林，龔寧波，杜冠華，呂揚

(北京協(xié)和醫(yī)學院，中國醫(yī)學科學院藥物研究所1.藥物晶型研究中心，晶型藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050；2.藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050)

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，是2015年版《中華人民共和國藥典》[1]收載的中藥材品種，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，臨床用于濕溫、暑濕、胎動不安等的治療[2]。黃芩藥材作為主要成分被用于安宮牛黃丸、安坤贊育丸、八寶坤順丸、參茸白鳳丸等中成藥[3]，黃芩中藥材質(zhì)量直接關系到中成藥產(chǎn)品質(zhì)量。因此，需要對黃芩中藥材的有效成分進行質(zhì)量控制[4-5]。

用95%乙醇提取中化學成分是研究中草藥中活性物質(zhì)的主要提取方法，而水煎法是數(shù)千年來中藥材在臨床疾病治療時的主要用藥方式，95%乙醇提取物和水提取物中均含有治療疾病的活性化學物質(zhì)。因此，研制中藥材95%乙醇提取物及水提取物標準物質(zhì)，并以黃芩素作為指標成分定值，具有科學意義和實際應用價值[6]。

筆者在本實驗完成了黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素成分分析國家級標準物質(zhì)的研制，確定了藥材、醇提物、水提物3種不同基質(zhì)中黃芩素成分含量的標準值與不確定度值[7]。黃芩及其提取物中黃芩素成分分析標準物質(zhì)的研制，可為我國黃芩中藥材及中成藥研制和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供物質(zhì)基準。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司，DAD檢測器，Agilent chemstation工作站；XS105型電子分析天平(Mettler公司，感量：0 g≤m≤5 g，0.01 mg；5 g

1.2國家一級標準物質(zhì)黃芩素 化學純標準物質(zhì)，證書編號：GBW09516，純度標準值及不確定度值(99.72±0.25)% (k=2)(中國醫(yī)學科學院藥物研究所研制)。

1.3中藥材及其提取物

1.3.1黃芩中藥材 產(chǎn)地河北省，經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥物研究所馬林教授鑒定為正品，質(zhì)量檢查符合《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定要求[1]。黃芩中藥材經(jīng)除塵、粉碎、并過篩孔內(nèi)徑(250±9.9) μm(65目)篩，備用。精密稱取樣品1 g置棕色安瓿瓶密封包裝，共完成500支最小包裝1 g量的黃芩中藥材成分分析標準物質(zhì)候選物樣品的制備工作。

1.3.2黃芩95%乙醇提取物 取黃芩中藥材，粉碎后以5倍量95%乙醇作為提取溶劑，經(jīng)加熱回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮得浸膏，真空干燥，粉碎并過篩孔內(nèi)徑(250±9.9) μm(65目)篩，得棕紅色干粉，即為黃芩95%乙醇提取物，備用。精密稱取樣品100 mg，置棕色安瓿瓶密封包裝，共完成500支最小包裝100 mg量的黃芩95%乙醇提取物成分分析標準物質(zhì)候選物樣品的制備工作。

1.3.3黃芩水提取物 取黃芩中藥材粉碎，加入6倍量純凈水，煎煮1 h，濾過，得提取液，將藥渣加入與提取液等體積的純凈水，煎煮1 h，濾過，再次向藥渣中加入與提取液等體積純凈水，繼續(xù)煎煮1 h，濾過。合并上述提取液，水浴揮干后，75 ℃真空干燥，得棕色粉末，即為黃芩水提取物，備用。精密稱取100 mg樣品置于棕色安瓿瓶密封包裝，共計完成了500支最小包裝100 mg量的黃芩水提取物成分分析標準物質(zhì)候選物樣品的制備工作。

1.4試劑 甲醇(Fisher Chemical，色譜純)，磷酸(分析純，北京化學試劑公司)，娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

2 方法與結果

2.1含量測定

2.1.1色譜條件 Agilent XDB C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 mm)；流動相：甲醇：0.4%磷酸=51：49；梯度洗脫程序：0～17 min(51%甲醇)；17～25 min(51%→70%甲醇)；后運行5 min；流速1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃；進樣量10 mL；檢測波長275 nm。

2.1.2溶液的制備 標準儲備液制備方法：精密稱取黃芩素化學純標準物質(zhì)5.09 mg(按化學純度99.72%計)，置于50 mL量瓶，用色譜級甲醇將樣品完全溶解，并定容至刻度，搖勻，配制成黃芩素為101.52 mg·L-1標準儲備液。精密移取0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL分別置于10 mL量瓶，用色譜級甲醇稀釋至刻度，獲黃芩素為1.0，5.1，10.2，20.3，50.8，101.5 mg·L-1標準溶液。

樣品提取方法：精密稱取黃芩中黃芩素成分分析標準物質(zhì)樣品100 mg、黃芩95%乙醇提取物中黃芩素成分分析標準物質(zhì)樣品30 mg、黃芩水提取物中黃芩素成分分析標準物質(zhì)樣品30 mg，分別置具塞錐形瓶，精密加95%乙醇：鹽酸=7：3混合溶液20 mL(95%乙醇提取物、水提取物為10 mL)，置90 ℃水浴中回流3 h，放冷，濾過，濾液置100 mL量瓶，用少量95%乙醇分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻。準確量取1 mL，分別置10 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2方法學考察

2.2.1線性關系考察 分別精密移取6種不同濃度標準溶液10 μL，注入液相色譜儀，按照“2.1.1”項色譜條件，記錄色譜圖及峰面積。色譜峰面積分別為38.68，198.35，389.67，802.44，1982.56，4003.11，以黃芩素標準溶液濃度為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸，獲得回歸方程為Y=39.424X-4.8638(r=1.0000，n=6)。標準曲線實驗結果表明，黃芩素標準溶液在1.0～101.5 mg·L-1范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.2精密度實驗 精密吸取101.5 mg·L-1黃芩素標準儲備液1 mL至10 mL量瓶，用色譜純甲醇稀釋至刻度。采用高效液相色譜法，按照“2.1.1”項色譜條件，重復測定6次，記錄色譜圖，黃芩素峰面積分別為369.68，369.82，369.33，369.47，369.60，369.66，RSD為0.05%，表明儀器精密度良好。

準確稱取自制黃芩素純度標準物質(zhì)5.09 mg(按化學純度99.72%計)6份，置50 mL量瓶，用甲醇將樣品溶解，并定容至刻度，獲得101.52 mg·L-1標準儲備溶液。準確吸取1.0 mL置10 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度。采用高效液相色譜法，按照“2.1.1”項色譜條件，各重復進樣3次，分別記錄色譜圖，獲得黃芩素色譜面積均值/稱樣量為72.953，72.423，72.770，72.246，72.017，72.182，RSD為0.50%，表明實驗方法精密度良好。

2.2.3重復性實驗 分別稱取黃芩中藥材、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物樣品各6份，按照“2.1.2”項樣品提取方法，按照“2.1.1”項色譜條件進行測定。黃芩中黃芩素含量分別為8.084%，8.160%，8.162%，8.174%，8.005%，8.284%，平均8.145%，RSD 1.15%；黃芩95%乙醇提取物中黃芩素含量分別為4.333%，4.301%，4.342%，4.282%，4.284%，4.292%，平均4.306%，RSD為0.60%；黃芩水提取物中黃芩素含量分別為9.165%，9.122%，9.021%，9.070%，8.873%，9.026%，平均9.046%，RSD為1.12%。表明黃芩中藥材、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物系列標準物質(zhì)溶液制備方法重復性良好。

2.2.4回收率實驗 分別稱取黃芩中藥材100 mg、黃芩95%乙醇提取物30 mg、黃芩水提取物樣品30 mg各6份，分別加入黃芩素純度標準物質(zhì)作為加標樣品。按照“2.1.2”項樣品提取方法制備樣品，采用HPLC法按照“2.1.1”項色譜條件測定黃芩素含量，計算回收率。黃芩中黃芩素回收率分別為100.50%，99.45%，98.64%，99.64%，99.77%，97.91%，平均回收率99.32%，RSD為0.92%；黃芩95%乙醇提取物中黃芩素回收率分別為100.89%，99.90%，98.79%，101.84%，98.34%，101.52%，平均回收率為100.21%，RSD為1.44%；黃芩水提取物中黃芩素的回收率分別為100.32%，99.47%，100.65%，101.63%，99.01%，99.02%，平均回收率100.02%，RSD為1.04%，結果表明方法回收率良好。

2.3均勻性實驗 從500 支標準物質(zhì)候選物中采用簡單隨機抽樣方法抽取15 瓶樣品，每瓶樣品平行取樣3 份，均按照“2.1.2”項樣品提取方法，按照“2.1.1”項色譜條件測定黃芩素含量，分別獲得45 個均勻性檢驗數(shù)據(jù)。黃芩中藥材、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物的均勻性數(shù)據(jù)見表1。

采用單因素方差分析(One Way Anova)[8]對均勻性數(shù)據(jù)進行組內(nèi)和組間統(tǒng)計分析，測定黃芩中藥材、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素含量，F(xiàn)分別為1.24，1.21，1.29；均小于臨界值[F0.05(14，30)=2.04]，即，F(xiàn)

2.4長期穩(wěn)定性實驗 將密封包裝后的標準物質(zhì)候選物樣品放置在常溫條件下長期保存，考察樣品穩(wěn)定性，并分別于0，1，2，4，6，12 個月隨機抽樣，每個點隨機抽樣6 瓶，按照“2.1.2”項樣品提取方法，按照“2.1.1”項色譜條件測定黃芩素含量，實驗測定結果見表2。以X代表時間(月)，以Y代表黃芩素含量值，分別擬合直線，獲得直線方程，計算斜率的不確定度[9-10]，結果分別為：

表1黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素成分含量均勻性檢驗結果

Tab.1ResultsofuniformitytestonbaicaleincontentinScutellariaBaicalensisandits95%alcoholextractandwaterextract

成分1abc2abc3abc4abc5abc黃芩8.2828.3788.3308.4558.2538.4548.2178.1978.3087.7868.4498.1818.3998.2898.431黃芩95%乙醇提取物4.3634.3994.2884.2894.3644.3584.3174.3544.3614.3534.3774.4144.3184.3134.298黃芩水提取物9.3359.0219.0779.0289.2369.1279.2819.3778.7849.2628.7488.8909.4618.7218.854成分6abc7abc8abc9abc10abc黃芩8.4448.4858.3588.4788.4058.2298.4568.2488.6228.3618.3888.4138.4628.4238.210黃芩95%乙醇提取物4.3154.3554.4544.3954.3974.4184.4204.4214.3674.3844.3384.4374.4764.4104.308黃芩水提取物8.8708.9498.8908.7599.0318.6278.5679.3059.0119.0708.9179.0519.0579.4809.137成分11abc12abc13abc14abc15abc黃芩8.5398.0528.4408.2568.5588.0998.4188.5217.9917.7027.8888.3308.2188.4008.394黃芩95%乙醇提取物4.3354.4944.4064.3824.3764.4014.4084.3914.3064.4064.3364.4174.4184.4054.424黃芩水提取物9.0799.0549.3719.6808.8889.8558.9099.44110.2289.3208.6848.5698.9709.0368.742

黃芩水提取物中黃芩素：Y=0.000 08X+0.0935

2.5黃芩素含量標準值定值 依據(jù)國家標準物質(zhì)技術規(guī)范[10]，采用6家實驗室聯(lián)合定值方法對黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素成分進行定值，定值數(shù)據(jù)見表3。采用格拉布斯檢驗，剔除可疑值，并采用科克倫(Cochran)等精度檢驗，證明黃芩素成分含量的測量數(shù)據(jù)均屬等精度數(shù)據(jù)。計算獲得6家聯(lián)合定值的黃芩中黃芩素成分含量標準值P=7.952%，S=0.001 631；黃芩95%乙醇提取物中黃芩素成分含量標準值P=4.285%，S=0.000 408；黃芩水提取物中黃芩素成分含量標準值P=8.800%，S=0.002 375。

2.6不確定度評定

2.6.1成分含量標準值的不確定度評估 黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素成分分析標準物質(zhì)的總不確定度由3個部分組成：測量標準值引入的不確定度、樣品不均勻性引入的不確定度、樣品穩(wěn)定性引入的不確定度。其中，測量標準值引入的不確定度包含國家一級標準物質(zhì)引入的不確定度、中藥材及其提取物中有效成分提取及含量測定過程引入的不確定度以及聯(lián)合定值的標準曲線擬合引入的不確定度等。

2.6.2標準值的不確定度計算 ①黃芩素一級標準物質(zhì)引入的不確定度值u(P)。黃芩素純度標準物質(zhì)的量值為(99.72±0.25)%，其標準不確定度值為0.25%/2=0.125%，相對標準不確定度值為u(P)=0.125%/99.72% =0.00125。②測量數(shù)據(jù)的不確定度值u(f)。利用測量數(shù)據(jù)計算：

表2黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素成分含量長期穩(wěn)定性結果

Tab.2Resultsoflong-termstabilitytestonbaicaleincontentinScutellariaBaicalensisandits95%alcoholextractandwaterextract

%

表3 黃芩、黃芩 95% 乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素含量的聯(lián)合定值

③聯(lián)合定值的標準曲線擬合引入的不確定度值urel。按照文獻[11]規(guī)定，標準曲線擬合的標準偏差計算公式為：

S(y)：標準溶液峰面積的標準偏差；q：黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物溶液的測定次數(shù)；n：標準溶液的個數(shù)×每個標準溶液的測定次數(shù)；C0：標準溶液的濃度(mg·mL-1)；C1：中藥材黃芩、95%乙醇提取物、水提取物溶液的濃度(mg·mL-1)；i：第n個校準溶液的第n次測量。以x代表檢測樣品的溶液濃度，以y代表檢測樣品的吸光度，分別擬合獲得直線聯(lián)合標定單位的標準曲線相對不確定度urel值，結果見表4。

比較6家單位獲得的標準曲線相對標準不確定度值，取最大值分別為：黃芩中黃芩素成分含量標準曲線的不確定度urel=0.005 158，黃芩95%乙醇提取物中黃芩素成分含量標準曲線的不確定度urel=0.003 147，黃芩水提取物中黃芩素成分含量標準曲線的不確定度urel=0.014 94。

表4聯(lián)合定值標準曲線引入的相對不確定度

Tab.4Relativeuncertaintyintroducedbystandardcurve

序號黃芩黃芩95%乙醇提取物黃芩水提取物10.002 1420.001 2860.006 40020.005 1580.003 1470.014 9430.004 7930.002 8970.014 1340.003 1790.002 0120.009 97550.003 8970.002 4790.011 8960.003 8120.002 3080.011 29

④合成標準不確定度計算，按照Uc(x)=

2.6.6擴展不確定度 由總合成標準不確定度計算擴展不確定度(U)，擴展因子k=2，黃芩、黃芩95%乙醇提取物、黃芩水提取物中黃芩素成分分析標準物質(zhì)的擴展不確定度分別為0.222%，0.117%，0.398%。

2.7成分含量標準值及不確定度表示 在測量不確定度的最終計算中，一般采用只進不舍的規(guī)則。故黃芩中黃芩素成分分析標準物質(zhì)定值結果為(7.95±0.23)%，k=2；黃芩95%乙醇提取物中黃芩素成分分析標準物質(zhì)定值結果為(4.29±0.12)%，k=2；黃芩水提取物中黃芩素成分分析標準物質(zhì)定值結果為(8.80±0.40)%，k=2。

3 討論

筆者在本實驗通過采用單一化學成分標識復雜成分體系的量值傳遞技術路線，采用高效液相色譜法-多家實驗室協(xié)作標定的方法，成功研制了黃芩中黃芩素成分分析標準物質(zhì)GBW(E)090438、黃芩95%乙醇提取物中黃芩素成分分析標準物質(zhì)GBW(E)090447、黃芩水提取物中黃芩素成分分析標準物質(zhì)GBW(E)090453，解決了中藥材及其提取物等復雜體系中的相關化學成分的量值溯源性科學技術難題，為中藥相同類型標準物質(zhì)的研制起到了指導和示范作用。

筆者在本實驗研制的黃芩及其提取物中黃芩素成分分析系列標準物質(zhì)均含有準確的量值與不確定度，屬國家二級計量有證標準物質(zhì)，具量值溯源和量值傳遞功能，在國內(nèi)外均屬首次研制，填補了標準物質(zhì)領域的品種空白。同時為提高我國中藥材及中成藥的質(zhì)量標準、推動中藥的標準化和現(xiàn)代化提供了標準物質(zhì)、物質(zhì)標準、標準技術方法。