聯(lián)合檢測(cè)CK19、BRAF及FAK在甲狀腺乳頭狀癌中的診斷價(jià)值

史國(guó)恩，包萬(wàn)智，李軼春，陳曉明，蔡漢章，潘能武

廣西北海市中醫(yī)醫(yī)院普外科,廣西北海 536000

甲狀腺乳頭狀癌起源于濾泡上皮細(xì)胞，是一種分化良好的惡性腫瘤，占原發(fā)性甲狀腺惡性腫瘤的55%～65%，可發(fā)生在任何年齡，多見(jiàn)于40歲以下，男女比例為1∶(2～4)。5年生存率為73%～93%，10年生存率為60%～83%[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)近年來(lái)甲狀腺癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。隨著免疫組化的發(fā)展，早期診斷和及時(shí)治療是提高甲狀腺乳頭狀癌生存率的關(guān)鍵。細(xì)胞角蛋白19(CK19)的聯(lián)合檢測(cè)BRAF基因表達(dá)、粘著斑激酶(FAK)、CK19、BRAF 和 FAK 均在甲狀腺乳頭狀癌[2]中高表達(dá)，提示CK19、FAK和BRAF的表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。該文收集了該院2013年1月—2018年1月收治的60例甲狀腺乳頭狀癌的存檔蠟塊，以分析細(xì)胞角蛋白19(CK19)、BRAF基因表達(dá)、粘著斑激酶(FAK)在甲狀腺癌中的表達(dá)，探討CK19、BRAF和FAK在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在該院治療的甲狀腺乳頭狀癌60例。其中男13例，女47例，年齡最小23歲。最大年齡為73歲，平均年齡為(48.5±6.7)歲；所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理診斷為乳頭狀甲狀腺癌，甲狀腺乳頭狀癌患者術(shù)前未接受放療或化療。研究所選病例已經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬對(duì)該研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 應(yīng)用試劑 鼠抗人CK19單克隆抗體，濃縮型鼠抗人FAK單克隆抗體和Envision檢測(cè)試劑盒，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑和基因組DNA抽提試劑盒[3]。

1.2.2 操作方法 ①免疫組化法檢測(cè) CK19、FAK、BRAF蛋白表達(dá)，使用Envision兩步法，將陽(yáng)性切片作為對(duì)照品，將PBS作為陰性對(duì)照。每個(gè)切片選擇5次四百次視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率和著色度計(jì)分，根據(jù)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞所占比記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分比，包括無(wú)著色為 0分，＜25%記作1分，26%～50%記作2分，51%～75%記作3分，＞75%記作4分[4]。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞著色特征將其記錄為無(wú)著色記作0分，淡黃色記作1分，棕黃色記作2分，棕褐色記作3分，將上述結(jié)果相加，0分為陰性，2～3分為弱陽(yáng)性，4～5分為中等陽(yáng)性，6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性。②聚合酶鏈反應(yīng)和DNA測(cè)序檢測(cè)BRAF突變，根據(jù)DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)從組織標(biāo)本中提取DNA，然后用上游引物和下游引物擴(kuò)增DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)產(chǎn)物可靠性，之后將產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，將結(jié)果與DNA序列進(jìn)行比較，明確其突變情況[5]。觀察CK19、BRAF和FAK蛋白在乳頭狀癌組織中的表達(dá)，比較CK19、BRAF和FAK蛋白標(biāo)志物的敏感性和特異性，以及與臨床病理參數(shù)腫塊大小、淋巴結(jié)侵襲、局部復(fù)發(fā)的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有患者的資料進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料采用%表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CK19、FAK、BRAF 蛋白表達(dá)

CK19表達(dá)部位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，患者陽(yáng)性表達(dá)率為100.00%；FAK在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒陽(yáng)性，少數(shù)核染色，患者陽(yáng)性表達(dá)率為73.50%，主要表現(xiàn)為中等及以上強(qiáng)度；BRAF蛋白表達(dá)部位在細(xì)胞膜，部分觀察到腺腔邊緣著色，患者陽(yáng)性表達(dá)率為63.33%，主要表現(xiàn)為中等及以上強(qiáng)度。CK19、FAK、BRAF蛋白表達(dá)在患者當(dāng)中的表達(dá)情況見(jiàn)表1。

表1 該組患者CK19、FAK、BRAF蛋白表達(dá)

2.2 患者 CK19、CK19、FAK、BRAF蛋白表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系

不同年齡、性別、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況CK19、FAK、BRAF蛋白表達(dá)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 2。

表2 患者CK19、FAK、BRAF蛋白表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系

CK19(+)特異性和敏感性在甲狀腺乳頭狀癌中分別為49.90%和100.00%；FAK(+)特異度和靈敏度分別為73.50%和96.50%；BRAF(+)的特異性和敏感性分別為 63.30%和 97.70%；BRAF(+)聯(lián)合 FAK(+)的特異性和敏感性分別為97.30%和95.30%；BRAF(+)與CK19(+)聯(lián)合的特異性和敏感性分別為95.80%和94.60%。CK19(+)與FAK(+)靈敏度分別為92.90%和94.70%；CK19(+)聯(lián)合 BRAF(+)、FAK(+)特異度和靈敏度分別為94.20%和98.80%；CK19聯(lián)合其他指標(biāo)表達(dá)比較可以看出，BRAF、CK19或者FAK同時(shí)表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌診斷鑒別的特異度和靈敏度最高。

2.3 患者BRAF基因突變情況分析

按照BRAF基因突變測(cè)序結(jié)果可以看出，該組38例外顯子15突變1 799例，屬于雜合突變，突變率為63.33%。BRAF基因突變?cè)诓煌挲g段、性別、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移當(dāng)中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌約占80%；全球甲狀腺癌發(fā)病率為1%～2%[6]，中國(guó)甲狀腺癌的年發(fā)病率為0.5～40人/100 000。雖然絕大多數(shù)甲狀腺癌可以通過(guò)手術(shù)和藥物治療治愈，但10%～20%的患者仍然死于腫瘤的低分化和進(jìn)展。近年來(lái)中國(guó)甲狀腺癌發(fā)病率逐年上升，尤其是女性，對(duì)人類(lèi)健康有害。甲狀腺癌的具體病因尚不清楚，但多年的臨床和流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，放療、激素效應(yīng)、碘攝入量等與甲狀腺癌的發(fā)生有關(guān)。

CK19為I型CK，分子量為40 KD；其主要表達(dá)于單層上皮細(xì)胞，分布于扁平鱗狀上皮基底細(xì)胞。國(guó)內(nèi)外許多研究者[7-10]已發(fā)現(xiàn)CK19在乳腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、大腸癌、膀胱癌、肺鱗癌等多種腫瘤組織中的表達(dá)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)低分子量角蛋白CK19在甲狀腺病變中的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈強(qiáng)而彌漫的表達(dá)，而在正常甲狀腺組織、甲狀腺腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫或局灶性表達(dá)中則不表達(dá)，推測(cè)CK19可能參與甲狀腺乳頭癌的發(fā)生和發(fā)展與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。

BRAF位于7q34，能有效地作用于MAPK信號(hào)通路，BRAF基因突變發(fā)生在甲狀腺癌患者中，常見(jiàn)突變點(diǎn)為第15外顯子1799位點(diǎn)；此次研究結(jié)果顯示38例BRAF突變，突變率為63.33%，并且與不同年齡、性別、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)顯著差異。

FAK是一種非受體酪氨酸激酶，它與酪氨酸激酶2和細(xì)胞黏附激酶β形成FAK家族，F(xiàn)AK抑制細(xì)胞凋亡，F(xiàn)AK是一個(gè)依賴(lài)于錨的生存信號(hào)，當(dāng)FAK表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中被抑制時(shí)，可引起細(xì)胞凋亡。FAK的高表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞外信號(hào)的存活，抑制腫瘤細(xì)胞失去粘附后的失巢凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。此次研究結(jié)果表明，F(xiàn)AK在甲狀腺乳頭狀癌中呈陽(yáng)性表達(dá)，F(xiàn)AK的高表達(dá)增加了甲狀腺乳頭狀癌的細(xì)胞外存活信號(hào)，F(xiàn)AK在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。

該次研究結(jié)果顯示甲狀腺乳頭狀癌患者的CK19陽(yáng)性表達(dá)率為100.00%，F(xiàn)AK陽(yáng)性表達(dá)率為73.5%，BRAF突變率為 63.33%，張芳等[11]在 CD56、CK19及BRAF診斷甲狀腺乳頭狀癌的研究中得出30例甲狀腺乳頭狀癌患者中CK19陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)為29例，陽(yáng)性表達(dá)率為96.70%，BRAF突變率為63.33%，與該次研究結(jié)果相近，而高玉寶等[12]在研究中得出FAK在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為75.00%，與該次研究結(jié)果相近。可見(jiàn)CK19、FAK陽(yáng)性表達(dá)和BRAF突變與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生存在密切關(guān)系。

4 結(jié)語(yǔ)

CK19、FAK和BRAF聯(lián)合檢測(cè)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的敏感性、特異性分別為94.60%和98.80%，高于單抗體或其他兩種組合。綜上所述在診斷甲狀腺乳頭狀癌患者時(shí)，聯(lián)合檢測(cè)CK19、FAK、BRAF表達(dá)的病理價(jià)值比較高，并且BRAF突變時(shí)導(dǎo)致患者出現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌的重要指標(biāo)，對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的臨床確診具有顯著作用。