逍遙解郁方對卒中后抑郁大鼠5-HT含量及其受體表達影響的研究*

吳春嵐，王長德，陳 婡

上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(上海200082)

卒中后抑郁(Post-stork depression，PSD)是卒中常見的并發(fā)癥之一，以情緒低落、興趣減退、思維遲緩及睡眠障礙為主要表現(xiàn)的疾病，嚴重影響卒中患者的治療、康復及預(yù)后，增加卒中患者的致殘率及死亡率。大型流行病學調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，39.3% ～ 70% 的腦卒中患者存在 PSD，而患有 PSD 患者病死率較單純腦卒中患者高出 3 ～ 4 倍，因此臨床將 PSD 視為預(yù)防二次腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。西醫(yī)抗抑郁藥是目前治療該疾病的主要手段，但因其副作用明顯，患者耐受性差、醫(yī)療經(jīng)濟負擔重等影響治療的依從性。卒中后抑郁屬中醫(yī)學“郁證”與“中風”之合病，在中風的基礎(chǔ)上， 因風、火、痰、瘀郁結(jié)導致機體氣血郁滯、肝失疏泄而出現(xiàn)情緒低落等抑郁的表現(xiàn)。肝喜條達，調(diào)暢全身氣機， 各種病因致肝臟功能失調(diào)，影響肝臟對氣機的調(diào)節(jié)作用，故生風，誠如《內(nèi)經(jīng)》所言：“諸風掉眩，皆屬于肝”。因此，疏肝行氣解郁為卒中后抑郁的治療原則。逍遙解郁方在我科臨床使用多年，具有一定的臨床療效，且副作用小，具有一定的研究潛力和優(yōu)勢[2]。本研究通過比較藥物干預(yù)后大鼠5-HT含量及-HT1AR與5-HT2AR mRNA表達變化探討逍遙解郁方治療卒中后抑郁方的可能作用機制及療效。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物：選取SPF級，SD大鼠50只，體重200～240 g，購自于上海西普爾-必凱實驗動物有限責任公司，動物許可證號：SCXK(滬)2015-0016。

1.2 實驗藥物:逍遙解郁方由柴胡、當歸、枳殼、合歡皮、炒棗仁、白術(shù)各15 g，香附、郁金、石菖蒲各12 g，白芍、夜交藤各30 g組成，以上中藥由上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室制備成顆粒劑形式。鹽酸氟西汀膠囊(美國禮來蘇州制藥有限公司生產(chǎn)，批號5558A)。

1.3 實驗儀器和試劑:實驗涉及儀器包括：ABI-7300型Real-time檢測儀(ABI公司)；紫外分光光度計(上海光學儀器廠)；TG-16M型低溫冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；K30型旋渦振蕩器(青浦瀘西儀器廠)；PRO200型電動勻漿機(FLUKO)等。大鼠5-羥色胺酶聯(lián)免疫分析試劑盒(貨號RA20031)；大鼠Trizol試劑盒(貨號1596-026)等。

2 方 法

2.1 分組與給藥方法:50只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為空白組、模型組、氟西汀組、中藥低劑量組和中藥高劑量組，每組10只。卒中后抑郁模型建立成功后，分別對各組大鼠進行行為學評估(包括：強迫游泳實驗[3]和糖水偏好試驗等[4])，各組大鼠按照：空白組和模型組[蒸餾水10 ml/(kg·d)、氟西汀組1.84 mg/(kg·d)]和中藥低、高劑量組[分別按生藥5.99 g/(kg·d),11.99 g/(kg·d)]方式連續(xù)灌胃28 d，給藥結(jié)束后再次進行行為學評定。

2.2 卒中后抑郁模型的建立:腦卒中模型的復制參照Koizumi等[5]方法進行改良，采用頸內(nèi)動脈線栓法制備MCAO模型，術(shù)后24h按Zea Longa標準[2]行神經(jīng)功能評分。在腦卒中模型基礎(chǔ)上采用慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激(CUMS)法聯(lián)合孤養(yǎng)法制備卒中后抑郁模型[3]。

2.3 大鼠血清5-HT含量測定:取大鼠血漿根據(jù)要求選擇EDTA作為抗凝劑，2～8℃1000×g離心15 min左右，取上清液，-80℃保存，按照試劑盒說明書操作測定各組大鼠血清5-HT含量。

2.4 大鼠海馬5-HT1AR與5-HT2AR mRNA表達水平檢測:取大鼠海馬組織于1 ml的Trizol的勻漿管中，于勻漿機勻漿20 s，立即放于冰上；置于超凈臺中，溫育5 min，12000 r/min，離心10 min；吸上清于新的1.5 ml離心管中，加入200 μl的氯仿，搖勻，室溫靜置2 min，4 ℃，12000 r/min，離心10 min；吸取上清于新的1.5 ml離心管中，加入600 μl的異丙醇，混合均勻，室溫靜置15 min，4℃，12000 r/min，離心15 min，棄上清；加入1 ml的75%的無水乙醇(750 μl無水乙醇+250μl DEPC水)漂洗沉淀，4℃，12000 r/min，離心5 min，棄上清；加入1 ml無水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000 r/min，離心5 min，棄上清，室溫干燥10 min；加入40 μl的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫唧w操作及數(shù)據(jù)處理見試劑盒說明書。PCR引物序列及擴增長度見表1。

表1 PCR引物序列、擴增長度

結(jié) 果

1 強迫游泳實驗 由表2發(fā)現(xiàn)，給藥前，各組PSD大鼠與空白組比較，其不動時間明顯增加，掙扎時間明顯減少(P<0.01)，提示造模成功。治療后，與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠掙扎時間明顯延長(P<0.01)，且各中藥干預(yù)組大鼠不動時間均明顯減少(P<0.01)；與氟西汀組比較，中藥低劑量組大鼠不動時間無明顯差異(P>0.05)，但掙扎時間明顯延長(P<0.05)；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組大鼠不動時間減少及掙扎時間增多更顯著(P<0.01)。

表2 各組大鼠強迫游泳時間比較(s)

2 糖水偏好實驗 由表3發(fā)現(xiàn)，給藥前，各組PSD大鼠糖水消耗量與空白組比較均顯著減少(P<0.05)，提示造模成功。治療后，與模型組比較，各藥物干預(yù)組糖水消耗量均增加(P<0.05)，提示以上3組藥物治療均有效。進一步觀察，與氟西汀組比較，中藥低劑量組大鼠糖水消耗明顯減少(P<0.05)，中藥高劑量組大鼠糖水消耗無明顯差異(P>0.05)，提示逍遙解郁方高劑量組與氟西汀組療效相當。糖水偏好度(%)=飲用糖水量/總飲水量×100%

3 卒中后抑郁大鼠海馬5-HT及其受體表達 由表4發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，各組大鼠血清5-HT含量明顯降低(P<0.01)，提示造模成功。除空白組外，其余各組均表現(xiàn)為低血清5-HT濃度伴隨海馬組織5-HT1AR低表達及5-HT2AR高表達。與模型組比較，各組大鼠血清5-HT濃度明顯增加，同時伴海馬5-HT1AR表達增加(P<0.05或P<0.01)，中藥低劑量組5-HT2AR表達無明顯差異(P>0.05)，但中藥高劑量組和氟西汀組5-HT2AR表達明顯減少(P<0.05)；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組和氟西汀組5-HT2AR表達亦明顯減少(P<0.01)。

表3 各組大鼠糖水偏好度比較(%)

表4 各組大鼠海馬5-HT含量及其受體5-HT1AR、5-HT2AR表達比較

討 論

郁證的發(fā)病多由七情所傷，肝氣郁結(jié)；思慮勞倦，脾失健運；臟氣素虛，復加情志勞傷而成。卒中后抑郁屬于中醫(yī)“郁證”范疇，結(jié)合其中風后發(fā)病的特點，考慮其主要病機主要為脾虛濕困，氣滯血瘀，痰瘀交阻，肝氣郁結(jié)。我們經(jīng)長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)逍遙解郁方對卒中后抑郁患者治療有效。中風發(fā)病多由虛(陰虛、氣虛)、火(肝火、心火)、風(肝風、外風)、痰(風痰、濕痰)、氣(氣逆)、血(血瘀)六端相干為病，卒中后抑郁在此基礎(chǔ)上復因情志不暢而治病，臨床可表現(xiàn)為情志抑郁易怒，胸悶，善太息，腹脹噯氣，食欲不振，夜寐多夢，驚惕不安等。逍遙解郁方由《太平惠民和劑局方》中的逍遙散合《醫(yī)學統(tǒng)旨》中的柴胡疏肝散化裁而來。方中柴胡、香附均性苦平，疏肝解郁，行氣活血，共為君藥；白芍酸苦微寒，養(yǎng)血斂陰，柔肝緩急；當歸甘辛苦溫，養(yǎng)血和血，且其味辛散，乃血中氣藥。當歸與白芍同用，補肝體調(diào)肝用，使血和則肝和，血充則肝柔，共為臣藥；木郁則土衰，肝病易傳脾，故以白術(shù)補氣健脾、燥濕利水，枳殼理氣寬胸、消脹除痞，非但實土以御木乘，且使生化有源，又能調(diào)暢氣機，補而不滯，共為佐藥；合而成方，深合《素問·臟氣法時論》“肝苦急，急食甘以緩之”，“脾欲緩，急食甘以緩之”，“肝欲散，急食辛以散之”之旨?？墒垢斡舻檬?，血虛得養(yǎng)，脾弱得復，濕重得化，氣血兼顧，肝脾同調(diào)。同時，結(jié)合臨床患者頭暈頭重，夜寐不安等臨床表現(xiàn)，以菖蒲配伍郁金健脾化濕、開竅清心，棗仁、合歡皮、夜交藤同用養(yǎng)心安神。

卒中后抑郁屬于繼發(fā)性抑郁，抑郁癥的發(fā)生與遺傳、生物化學、心理、社會和環(huán)境等多種因素有關(guān)，其發(fā)病機制至今尚未明確。目前有關(guān)PSD的神經(jīng)生化研究主要集中在單胺能神經(jīng)遞質(zhì)假說，即5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)低下假說，尤其是5-羥色胺信號減弱被公認是抑郁癥的生物學基礎(chǔ)。早在20世紀80年代，Robinson等[6]就提出，5-HT作為腦內(nèi)參與情感調(diào)節(jié)的神經(jīng)元，其軸突通過丘腦和基底節(jié)到達額葉皮層，腦卒中病變累及上述部位可影響5-HT神經(jīng)通路，導致5-HT遞質(zhì)水平降低而引起抑郁。臨床上使用5-HT再攝取抑制劑(SSRI)可緩解PSD癥狀，進一步支持PSD與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)下降有關(guān)的觀點[7-11]。目前普遍認為，5-HT1AR和5-HT2AR均屬于自身受體，多分布在情感調(diào)節(jié)有關(guān)的邊緣系統(tǒng)中，尤其是海馬、額葉和中縫核，與抑郁癥關(guān)系密切[12-14]。當突觸后膜5-HT1AR水平降低和5-HT2AR水平升高均會抑制5-HT的釋放，前者對5-HT的釋放起負反饋作用，后者則對5-HT的釋放起正反饋作用，最終導致細胞間隙內(nèi)5-HT濃度降低，從而導致抑郁[15-17]。本次研究以5-HT1AR和5-HT2AR為切入點，探討逍遙解郁方治療卒中后抑郁可能的作用機制。

實驗結(jié)果顯示：逍遙解郁方高、低劑量和鹽酸氟西汀均可以上調(diào)5-HT1ARmRNA表達和下調(diào)5-HT2ARmRNA表達，PSD大鼠海馬5-HT含量增加，抑郁癥狀得到改善。該研究結(jié)論與大量動物實驗結(jié)果相符[18-20]。其次，由中藥高、低劑量療效比較，我們發(fā)現(xiàn)逍遙解郁方對抑郁改善程度上可能存在濃度依賴性。但是由于本次實驗動物樣本量太少，研究結(jié)論僅視為探索性研究，后期有待進一步擴大樣本量就該結(jié)論進行驗證，實驗中觀察發(fā)現(xiàn)的藥物量效關(guān)系有待進一步摸索論證。此外，動物模型療效是否與人體臨床療效相匹配需要臨床觀察性實驗進一步驗證，同時藥物應(yīng)用于臨床還需對其安全性進行監(jiān)測評估。